呼吸道合胞病毒重组蛋白抗原免疫应答平衡调控研究

发布时间：2018-04-03 22:45

  本文选题：呼吸道合胞病毒　切入点：免疫平衡　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2009年博士论文

【摘要】： 完善的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)疫苗,需同时具备激发细胞免疫和体液免疫的能力。CTL介导的细胞免疫在清除病原物方面作用显著,对RSV的预防尤为重要。因为,虽然RSV感染后体液免疫是主要的保护机制,但这种保护很不完全,患者在感染后较短时间内乃至终生易发生多次重复感染。同时,安全的RSV疫苗需要诱导平衡的免疫应答反应。单独的重组G蛋白或G蛋白片段仅诱导IgG1型抗体和Th2型细胞因子优势应答,不产生CD8+ T细胞免疫。 前期我们将含有B细胞表位的G蛋白片段G1和CD8+ T细胞表位的片段F1/M2:81-95的融合蛋白G1F1/M2免疫BALB/c小鼠同时诱导了高滴度的特异性抗体和CTL应答,而且CD8+ T的诱导下调了IgG1与IgG2a的比例。但融合蛋白G1F1/M2比含载体蛋白的融合蛋白DsbA-G1F1/M2所诱导的中和抗体弱;而且尽管IgG1/IgG2a的比例有所降低,但仍未达到自然感染时的水平。因此为进一步增强G1F1/M2诱导体液免疫和细胞免疫的能力,尤其是进一步增强MHCⅠ分子限制的CD8+ T细胞的激活,提高CTL活性,进一步调整Th1/Th2的比例,使免疫反应更加平衡,我们在G1F/M2融合蛋白中引入可以促进抗原交叉提呈的蛋白转导结构域HIV TAT或HSP70构建新的重组蛋白抗原,并对其抗原性和保护性等进行了研究。 在重组表达载体pET-G1F/M2的基础上,构建了两种新的重组融合蛋白表达载体,在原核表达系统中实现了重组蛋白的诱导表达,通过亲和层析分离纯化制备了用于动物免疫试验的重组抗原。通过设计引物进行PCR扩增的方式直接将蛋白转导结构域HIV TAT基因连接至G1F/M2基因的上游,构建新的重组融合蛋白TAT-G1F/M2。由于在原核表达系统中不能实现HSP70和G1F/M2的融合表达,因此构建了一个可以与HSP70高亲和力结合的融合蛋白Javelin-G1F/M2,在G1F/M2 N端引入的Javelin序列可以与热休克蛋白HSP70高亲和力结合。通过构建引物进行PCR扩增的方式直接将Javelin短肽基因引入至G1F/M2基因的上游。上述表达载体导入原核表达系统成功实现了重组融合蛋白的诱导表达,并采用Western-blot鉴定了重组蛋白的RSV抗原特异性。重组蛋白经Ni2+螯合亲和层析柱分离纯化,梯度透析复性后得到了纯度较高的重组蛋白。 在体外先将Javelin-G1F/M2和HSP70孵育制备HSP70: Javelin-G1F/M2复合物进行动物免疫,对复合物诱导IgG抗体及亚型、中和抗体、CTL应答以及保护性等进行了考察,并与Javelin-G1F/M2皮下免疫组和Javelin-G1F/M2铝佐剂腹腔免疫组进行比较研究。在不添加其他佐剂,皮下免疫的条件下HSP70: Javelin- G1F/M2复合物可诱导高滴度的IgG抗体和强的CTL应答,其抗体滴度和CTL应答强度均优于Javelin- G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫和单独Javelin-G1F/M2皮下免疫。HSP70: Javelin- G1F/M2复合物在诱导中和抗体方面与Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫基本相当。HSP70: Javelin-G1F/M2复合物可以诱导更为平衡的Th1/Th2应答,IgG的亚型IgG1/IgG2a的比值在攻毒前后均低于Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫组和单独Javelin-G1F/M2皮下免疫组;而且攻毒后肺组织嗜酸性粒细胞浸润的程度较Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫组轻。病毒滴定结果表明HSP70: Javelin- G1F/M2复合物可为小鼠提供完全的保护作用。 对重组融合蛋白TAT- G1F/M2诱导IgG抗体及亚型、中和抗体、CTL应答以及保护性等进行了考察,并与G1F/M2进行了比较研究。TAT-G1F/M2诱导的IgG抗体滴度和中和抗体滴度与G1F/M2免疫组基本相当,但其诱导的CTL应答强度要高于G1F/M2免疫组。而且TAT- G1F/M2诱导的IgG的亚型IgG1/IgG2a的比值在攻毒前后均低于G1F/M2免疫组。保护性试验表明TAT-G1F/M2可为小鼠提供完全的保护作用。 因此可见在G1F/M2融合蛋白的基础上引入蛋白转导结构域HIV TAT,或者将G1F/M2与热休克蛋白HSP70构建HSP70:G1F/M2复合物均可通过促进RSV抗原的交叉提呈,增强抗原G1F/M2的CTL应答,使Th1/Th2应答朝平衡的方向偏移,改善Th2优势应答导致的毒副作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【共引文献】

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本文编号：1707247