巴曲酶对人内皮祖细胞功能的影响及其机制的探讨

发布时间：2018-04-06 06:37

  本文选题：巴曲酶　切入点：内皮祖细胞　出处：《安徽医科大学》2009年硕士论文

【摘要】： 目的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)又称为内皮前体细胞。它们不仅参与胚胎时期的血管发生,也存在于成年体内的骨髓和外周血中,参与血管的修复和新生。目前,抗动脉硬化以及促血管新生的研究是临床研究的热点问题,已经证明自体EPCs的动员和移植是治疗性血管再生的一个有效方法。巴曲酶(batroxobin,DF-521)是从南美具窍腹蛇的蛇毒中分离出、提纯出的一种具有抗凝溶纤作用的丝氨酸蛋白酶。现广泛应用于包括脑梗塞和慢性下肢动脉硬化性闭塞症在内的多种缺血性心脑血管疾病的治疗。考虑DF-521可能通过影响EPCs来改善血管内皮结构与功能,促进血管新生,从而发挥临床作用。本研究旨在通过观察DF-521在体外环境下对EPCs的增殖、分化、成血管能力以及NO分泌能力的影响,来探讨DF-521的作用机制,并为EPCs的体外增殖、分化寻找可能的新诱导剂。方法取经过rhG-CSF动员的健康成人的外周血,密度梯度离心法提取单个核细胞,接种在hFN包被的培养板上,DMEM条件培养液(含FBS和VEGF)培养。培养至第6d,对贴壁细胞进行EPCs的鉴定:(1)倒置显微镜下观察贴壁细胞形态;(2)激光共聚焦显微镜观察经DiI-acLDL和FITC-UEA-I双染色的贴壁细胞;(3)流式细胞术检测贴壁细胞CD34、CD31、vWF、VEGFR的表达情况。EPCs随机为对照组(基本培养基)、实验组A(0.05U/ml DF-521),实验组B(0.1U/ml DF-521),实验组C(含0.2U/ml DF-521)。培养24h,NO试剂盒检测上清液NO浓度。继续48h,对EPCs进行计数。3d换液一次,培养至第14d和21d用流式细胞术对各组EPCs做CD31和vWF的表型检测。收集培养至21d的细胞,制备电子显微镜标本,电子透射电子显微镜观察细胞超微结构。鉴定完EPCs后,将EPCs按等浓度接种至基质胶上,按上述4组培养72h,观察EPCs生长情况,并用DiI-acLDL和FITC-UEA-I双染色,激光共聚焦显微镜再观察。结果EPCs的鉴定:EPCs呈梭形或圆形;DiI-acLDL和FITC-UEA-I双染色阳性,发黄色荧光;流式细胞术显示EPCs的表型为CD34+(26.13±8.51)%,CD31+(5.15±2.15)%,VEGFR-2+(15.16±1.31)%,vWF+(5.12±1.01)%。各实验组的NO浓度以及EPCs数量均明显大于对照组(P0.05),并且这个效应随DF-521浓度升高而增加(P0.05)。在第14d、21d,实验组的CD31和vWF表达强于对照组。在第21d,在实验组B,C的细胞呈铺路石样排列。电子透射显微镜观察到ECs特异性结构,即怀布尔-帕拉德小体。高剂量干预组的EPCs形成了条梭状结构和管腔样结构。结论在体外培养条件下,DF-521促进EPCs的增殖和成血管功能,并诱导其向ECs分化,改善其分泌NO的能力; DF-521对EPCs增殖和分泌NO能力的影响呈现剂量依赖关系;DF-521的这些作用可能与内皮型一氧化氮合酶有关。
[Abstract]:Objective Endothelial progenitor cells (EPCs) are also called endothelial progenitor cells (EPCs).They are not only involved in angiogenesis at embryonic stage, but also in bone marrow and peripheral blood in adults, and participate in the repair and regeneration of blood vessels.At present, the research of anti-arteriosclerosis and angiogenesis is a hot issue in clinical research. It has been proved that the mobilization and transplantation of autogenous EPCs is an effective method for the treatment of vascular regeneration.Batroxobin DF-521) is a serine protease with anticoagulant and fibrinolytic activity isolated from the venom of the South American snake.It is widely used in the treatment of ischemic cardiovascular and cerebrovascular diseases, including cerebral infarction and chronic arteriosclerotic obliteration of lower extremities.It is considered that DF-521 may improve the structure and function of vascular endothelium and promote angiogenesis by affecting EPCs.The aim of this study was to investigate the effect of DF-521 on the proliferation, differentiation, vascularization and no secretion of EPCs in vitro, to explore the mechanism of DF-521, and to find a new inducer for the proliferation and differentiation of EPCs in vitro.Methods Mononuclear cells were extracted from the peripheral blood of healthy adults mobilized by rhG-CSF and cultured in the conditioned medium (including FBS and VEGF) on the hFN coated culture plate by density gradient centrifugation.Identification of adherent cells by EPCs on the 6th day of culture: 1) observation of adherent cell morphology under inverted microscope) observation of adherent cells by confocal laser microscopy (DiI-acLDL and FITC-UEA-I double staining) flow cytometry to detect the expression of CD34- CD31vWFEGFR in adherent cellsEPCs were randomly divided into two groups: control group (basic medium, A(0.05U/ml DF-521), experimental group (B(0.1U/ml DF-521), and experimental group C (including 0.2U/ml DF-521).The concentration of no in supernatant was detected by 24 h culture.EPCs was counted for 48h. The phenotypes of CD31 and vWF were detected by flow cytometry on the 14th and 21st day after culture. The phenotypes of CD31 and vWF were detected by flow cytometry.The cells cultured for 21 days were collected and the ultrastructure of the cells was observed by electron transmission electron microscopy (TEM).After EPCs was identified, EPCs was inoculated into the matrix gel at the same concentration and cultured for 72 hours according to the above mentioned four groups. The growth of EPCs was observed by double staining of DiI-acLDL and FITC-UEA-I, and then observed by laser confocal microscope.Results EPCs were double stained with double staining of DiI-acLDL and FITC-UEA-I, and the phenotype of EPCs was CD34 26.13 卤8.51. The phenotype of EPCs was CD34 26.13 卤8.51. The phenotype of EPCs was 5.15 卤2.15 卤5.16 卤1.31. The phenotype of EPCs was 5.12 卤1.01.The concentration of no and the amount of EPCs in each experimental group were significantly higher than those in the control group, and the effect increased with the increase of DF-521 concentration.The expression of CD31 and vWF in the experimental group was stronger than that in the control group at day 14 and day 21.On the 21 th day, the cells of BMC in the experimental group were arranged like paving stones.The specific structure of ECs was observed by electron transmission microscope (TEM).In the high dose intervention group, EPCs formed a spindle-like structure and a lumen like structure.Conclusion DF-521 promotes the proliferation and angiogenesis of EPCs in vitro and induces its differentiation into ECs.The effects of DF-521 on the proliferation and secretion of no in EPCs were dose-dependent. These effects of DF-521 may be related to endothelial nitric oxide synthase.
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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本文编号：1718435