Aspirin抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用及其机制研究

发布时间：2018-04-11 09:03

  本文选题：阿司匹林 + 内皮细胞衰老　； 参考：《中国医科大学》2009年博士论文

【摘要】：前言 糖尿病人群患心血管并发症导致死亡的机率是正常人的2-4倍。因此探究糖尿病血管并发症的相关机制以及寻找有效的防治措施已经成为研究人员关注的焦点。糖尿病大血管病变的病理基础主要是动脉粥样硬化性改变。最近研究发现,内皮细胞衰老和动脉粥样硬化关系密切。正常生理状态下,内皮细胞的更新率很低,若不是因为受到损伤,其完全更新大约需要三年左右的时间。内皮细胞分裂能力有限,因损伤造成的不断分裂将导致内皮细胞端粒缩短,并进入生长停滞期,即衰老期,如血管分叉处的内皮细胞因受到血流切应力的作用易受损而发生反复分裂,该部位不但端粒较短,而且恰好是动脉粥样硬化的好发部位。Minamino研究显示,动脉粥样硬化斑块处内皮细胞与非斑块处的内皮细胞相比,呈现出衰老细胞的特征,如β-半乳糖苷酶(β-gal)染色阳性和端粒缩短等。同时,血管内皮细胞在衰老过程中,分泌的各种生物活性因子也在发生变化,如内皮依赖性血管舒张因子合成下降、炎性因子合成增加、粘附因子表达增多等。这些变化都将造成内皮功能障碍,最终导致动脉粥样硬化的发生。糖尿病患者与没有糖尿病人相比大血管疾病发病早,而且病变更加弥漫和严重,因此,高糖有可能因加速内皮细胞衰老而导致了糖尿病大血管病变。 解释细胞衰老的机制之一就是端粒学说。端粒是真核细胞染色体末端的DNA序列,细胞每分裂一次,其端粒DNA序列就丧失5-25bp,当端粒缩短到一定长度,便不能维持染色体的稳定,使细胞失去了分裂增殖能力而衰老、死亡,这种缩短就是细胞衰老的标志。端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶,可以在缩短的端粒末端加上新的重复序列,保持端粒长度以延缓细胞衰老进程。当端粒酶缺乏或失活时,端粒DNA因不能得到及时的补充和修复而缩短。细胞内很多因素可以调节端粒的长度和端粒酶的活性,非对称性二甲基精氨酸(asymmetricdimethylarginine,ADMA)就是其中之一。ADMA不但是NOS的内源性抑制剂,也是心血管疾病独立危险因素之一。研究发现ADMA因上调细胞内活性氧(reactive oxygen system,ROS)的水平,抑制NO的合成而具有诱导内皮细胞衰老的作用。此外,代谢ADMA的二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylargininedimethylaminohydrolase,DDAH)是一种对氧化应激敏感的酶类。来自Lin的研究发现,糖尿病患者体内氧化应激程度加重的同时,伴随有DDAH活性的下降和ADMA水平的升高。因此,降低细胞内氧化应激的水平或升高NO的水平都能有效地延缓内皮细胞的衰老和动脉粥样硬化的发生。 ROS在衰老的过程中起着重要的作用,ROS可通过抑制Src家族激酶的活性而缩短端粒的长度,推进衰老的进程。大量体内和体外的实验表明,高糖能引起机体和细胞内氧化应激水平的加重。这有可能是糖尿病人过早衰老的原因之一。在内皮细胞中,NO能与过量的ROS反应而减轻细胞内氧化应激的程度,但研究显示,衰老的细胞中NO水平明显下降。NO是一种重要的具有多种功能的信号分子,可调节血管管腔大小、抑制血小板聚集、抗凋亡、抑制平滑肌细胞增殖和白细胞黏附,因而在抗动脉粥样硬化过程中发挥着重要的作用。NO是在eNOS的作用下由L-精氨酸合成而来。研究证明,内皮细胞衰老过程中eNOS的表达和活性都明显下降,尽管其中的机制还不十分明确,但可以肯定的是,这是导致NO水平下降的直接原因。 Aspirin是具有百年历史的非甾体类解热镇痛药,现在已经被广泛地应用于心血管疾病,尤其是缺血性心脏病的防治中。最近研究发现,aspirin除具有抗栓、抗炎的作用外,还具有抗氧化和升高NO的作用,因此aspirin有可能具有抗内皮细胞衰老的潜质。 根据目前的研究状况,本项研究主要解决以下几个问题:(1)aspirin是否具有抗高糖诱导的内皮细胞衰老的作用;(2)这种抗衰老作用是否与aspirin升高细胞内NO,降低氧化应激的水平有关? 材料与方法 1、根据细胞形态学变化、β-gal染色阳性细胞数、PCR-ELISA法检测的细胞内端粒酶活性以及流式细胞仪检测的细胞周期分布特点评估内皮细胞衰老的程度。 2、采用经典的Griess法检测细胞上清液中总一氧化氮(NO_2~-/NO_3~-)水平。 3、根据细胞内DAF-FM DA荧光强度,荧光酶标仪检测细胞内总NOS活性。 4、采用Western blot方法检测细胞eNOS总蛋白表达和磷酸化eNOS(Ser-1177)蛋白表达。 5、采用RT-PCR方法检测细胞内eNOS mRNA表达。 6、根据细胞内DCFH-DA的荧光强度,流式细胞仪检测细胞内ROS的水平。 7、应用液质联用仪检测细胞内DDAH活性和ADMA水平。 结果 1、高糖环境下(11-33 mM葡萄糖)内皮细胞呈现出衰老的特征并随糖浓度的升高而加重。衰老的细胞体积增大,生长缓慢、扁平、胞内颗粒增多并出现多核现象;β-gal染色阳性细胞数增多。小剂量aspirin(0.01-1 mM)组细胞外观与正常糖浓度组(5.5 mM葡萄糖)相比无明显差异。与33 mM葡萄糖组相比,小剂量aspirin呈剂量依赖性地减少β-gal染色阳性细胞数(P＜0.05),升高细胞内端粒酶活性(P＜0.05),以48小时作用最为明显。细胞周期检测结果显示,1 mM aspirin可减少停滞于G_0/G_1期细胞百分率,升高S期和G_2/M期细胞百分率(P＜0.05)。3 mM aspirin与高糖组相比衰老程度无显著性差异(P＞0.05)。L-NAME(NOS抑制剂)完全消除小剂量aspirin抗高糖环境下细胞衰老的作用。 2、细胞内NO水平随33 mM葡萄糖作用时间延长而显著下降(P＜0.05)。0.01-1 mM aspirin剂量依赖性地提升细胞内NO水平(P＜0.05),1 mM aspirin呈时间依赖性地升高细胞内NO水平(P＜0.05)。3 mM aspirin组与高糖组相比,细胞内NO水平无显著性差异(P＞0.05)。L-NAME明显抑制aspirin升高NO的作用(P＜0.05)。 3、5.5mM葡萄糖、33 mM葡萄糖、33 mM葡萄糖+1 mM aspirin持续作用于内皮细胞48 h后,各组细胞中eNOS mRNA表达和eNOS总蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。 4、细胞内总NOS活性随33 mM葡萄糖作用时间延长而显著下降(P＜0.05)。0.01-1 mM aspirin剂量依赖性地提升细胞内总NOS活性(P＜0.05),1 mM aspirin呈时间依赖性地升高细胞内总NOS活性(P＜0.05)。3 mM aspirin组与高糖组细胞相比,细胞内总NOS活性无显著性差异(P＞0.05)。L-NAME显著抑制aspirin升高细胞内总NOS活性的作用。 5、33 mM葡萄糖作用内皮细胞48h,细胞内eNOS Ser-1177磷酸化水平显著低于正常糖浓度组细胞。高糖环境下0.01-3 mM aspirin作用内皮细胞48小时,0.01-1 mM aspirin剂量依赖性地提升细胞内eNOS Ser-1177磷酸化水平(P＜0.05),3 mM aspirin组与高糖组比无显著性差异。 6、细胞内ROS水平随33 mM葡萄糖作用时间延长而显著升高(P＜0.05)。0.01-1 mM aspirin剂量依赖性地降低细胞内ROS水平(P＜0.05),1 mM aspirin呈时间依赖性地降低细胞内ROS水平(P＜0.05)。3 mM aspirin组与高糖组相比,细胞内ROS水平无显著性差异(P＞0.05)。L-NAME抑制aspirin降低细胞内ROS水平的作用。 7、33 mM葡萄糖作用内皮细胞48h,细胞内DDAH的活性降低,ADMA水平升高。高糖环境下0.01-3 mM aspirin作用内皮细胞48小时后,0.01-1 mM aspirin剂量依赖性地提升细胞内DDAH的活性,降低ADMA水平。3 mM aspirin组与高糖组相比,细胞内DDAH的活性和ADMA水平无显著性差异(P＞0.05)。L-NAME抑制aspirin提升细胞内DDAH的活性和降低ADMA水平的作用。 结论 1、高糖可加速体外培养的人脐静脉内皮细胞衰老进程,细胞衰老的程度随糖浓度的增加和作用时间的延长而加重。 2、小剂量aspirin(0.01-1 mM)剂量依赖性地延缓高糖环境下内皮细胞衰老的进程,于48小时达到最大值。 3、高糖环境下小剂量aspirin通过升高HUVECs中NO的水平,降低ROS的水平发挥抗衰老作用。 4、高糖环境下小剂量aspirin升高HUVECs中NO的水平与提高细胞内NOS活性有关,但并不影响eNOS基因和总蛋白表达。 5、高糖环境下小剂量aspirin可使HUVECs中eNOS Ser-1177位点磷酸化而升高细胞内NOS活性。 6、高糖环境下小剂量aspirin可升高细胞内DDAH活性,降低ADMA水平。Aspirin的这种调节DDAH-ADMA系统的作用,有助于aspirin进一步发挥在高糖环境下抗内皮细胞衰老和抗动脉粥样硬化的作用。 7、高糖环境下3 mM aspirin不具有抗内皮细胞衰老的作用。
[Abstract]:Foreword

It is found that endothelial cells have a very close relationship between endothelial cell senescence and atherosclerosis . In normal physiological state , the endothelial cells have a very low rate of regeneration .

Human telomerase reverse transcriptase ( DDAH ) is one of the independent risk factors of oxidative stress .

ROS plays an important role in the course of aging . ROS can shorten telomeric length and advance the process of aging by inhibiting the activity of family kinase .

Recently , aspirin has been widely used in the prevention and treatment of cardiovascular diseases , especially ischemic heart disease . Recent studies have found that aspirin has anti - inflammatory and anti - inflammatory effects , so aspirin has the potential to have anti - endothelial cell aging .

According to the current research situation , this study mainly solves the following problems : ( 1 ) Whether aspirin has the effect of resisting high glucose - induced aging of endothelial cells ; ( 2 ) Whether this anti - aging effect is related to the increase of NO in the cells and the level of oxidative stress ?

Materials and Methods

1 . According to the morphological changes of cells , the number of 尾 - gal staining positive cells , the telomerase activity detected by PCR - ELISA and the cell cycle distribution characteristics detected by flow cytometry were used to assess the extent of endothelial cell aging .

2 . The level of total nitric oxide ( NO _ 2 ~ - / NO _ 3 ~ - ) was determined by the classical Griess method .

3 . The total NOS activity in the cells was detected by the fluorescence microplate reader according to the fluorescence intensity in the cells .

4 . Western blot was used to detect the expression of eNOS and the expression of phosphorylated eNOS ( Ser - 1177 ) protein .

5 . The expression of eNOS mRNA was detected by RT - PCR .

6 . According to the fluorescence intensity of DCFH - DA in the cell , flow cytometry detects the level of intracellular ROS .

7 . The levels of DDAH and ADMA in cells were detected by liquid chromatography .

Results

The results of cell cycle test showed that 1 mM aspirin could reduce the percentage of cells in G _ 0 / G _ 1 phase , increase S - phase and G _ 2 / M phase ( P < 0 . 05 ) .

2 . The level of NO in the cells was significantly decreased with the time of 33 mM glucose ( P < 0.05 ) . The level of NO in the cells was significantly increased ( P < 0.05 ) .

3 銆，

本文编号：1735335