无机盐和葡萄糖对广州管圆线虫三期幼虫的体外趋化作用研究

发布时间：2018-04-11 12:13

本文选题：无机盐 + 人工脑脊液　；参考：《南方医科大学》2013年硕士论文

【摘要】：广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis, AC)是引起人体嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎(亦称为广州管圆线虫病)的重要病原体。一般而言,人类生食或半生食带有AC感染期幼虫(三期幼虫,L3)的水产或蔬果而感染广州管圆线虫病。广州管圆线虫病散发流行于热带与亚热带地区,主要的病例报道集中在南太平洋诸岛、东南亚、中国等国家及地区。直至2011年,中国(包括港台地区)已有超过1000例广州管圆线虫病病例报告。近年来,随着该病疫源地的扩大、人们膳食结构的改变,而且人类的各种文化交流的日益频繁,该病的发病人数持续上升,甚至连非疫源地的地区(如欧洲,北美地区)也出现零星病例报告。广州管圆线虫病已给人类健康、公共卫生和社会安定带来严重危害,引起了政府部门的高度重视和社会的广泛关注。然而,作为一种新发传染病,广州管圆线虫病许多病原生物学特性和机制还不清楚,广州管圆线虫病的防制工作面临极大的挑战。在线虫家族中,已发现多种线虫有不同程度的化学趋向性。作为线虫模式生物的秀丽隐杆线虫,在化学趋避活动观察及其神经元参与通路和作用已经达到一定的深度。Bargmann认为神经元趋化作用在秀丽隐杆线虫的趋化活动与外部环境感知、觅食、生长发育、凋亡、活动导航等行为有关。经过数百种化学物质的筛选,Ward总结出5类秀丽隐杆线虫的吸引剂：(一)环核苷酸：cAMP, cGMP等；(二)阴离子：Cl-,Br-,I-等；(三)阳离子：Na+,Li+,K+,Mg2+等：(四)OH-；(五)其他：赖氨酸,组氨酸,半胱氨酸等。Tobata-Kudo等证实在NaCl梯度浓度平板上鼠类圆线虫L3幼虫具有吸引作用的梯度范围为20mmM-230mM,其中80mM区域尤为适应。Koga通过对鼠类圆线虫幼虫的化学趋化性及大鼠体内移行的研究,发现幼虫在到达小肠发育为成虫之前必然会途经脑部,并在体外实验中见幼虫对Na+以及血清白蛋白具有趋向性。Forbes等发现低浓度的NaCl可吸引粪类圆线虫感染期幼虫,而高浓度的NaCl对粪类圆线虫又有驱避作用。Adachi等发现秀丽隐杆线虫对氯化钠或异戊醇均有趋向性,且化学趋向性随着温度的增加而增强。Kusaba等发现许多动物(包括哺乳类,爬行类,鱼类以及无脊椎动物)的血清或血液对彭亨布鲁丝虫(Brugia pahangi)感染期幼虫具有显著的趋化活性,趋化指数(C.I.)达0.562～0.960(经标准化),而生理盐水对照组的C.I.仅为0.045(经标准化)。Liao等证实秀丽隐杆线虫对稀释至1000倍后的丙酮、2-丁酮、硝基甲烷、环己酮、RDX、乌洛托品等6种化合物有趋向性,而对稀释至1000倍后的H202、高氯酸钾、硫和硝化钾等4种化合物有驱避性；其中H202稀释100倍后仍具有驱避作用。 AC感染大鼠等适宜宿主后,L3穿过肠壁经血脑屏障移行入脑,经过一定发育过程后,将再次经血脑屏障移行至肺动脉发育为成虫；AC L3感染人、小鼠等非适宜宿主后,幼虫穿过肠壁经血脑屏障移行入脑并停留在脑内。可见,幼虫进入宿主脑内是其生活史中不可缺少的过程。什么因素驱使了广州管圆线虫幼虫的肠-脑-肺趋向性移行?研究发现秀丽隐杆线虫对氯化钠或异戊醇均有趋向性。低浓度的氯化钠可引诱粪类圆线虫感染性幼虫,而高浓度的氯化钠对幼虫有驱避作用。在相似领域中,尚未见有关广州管圆线虫幼虫化学趋向活动的文献或者实验报道。研究目的：本研究以不同浓度倍数(1、3、5、10倍)人工脑脊液以及不同浓度(20mM、50mM、100mM和150mM)的无机盐与葡萄糖对广州管圆线虫三期幼虫进行体外趋化实验,并在体视显微镜下观察对AC L3幼虫的趋化效果。并根据上述不同溶液在趋化平板中溶液区和对照区的AC L3数进行人工收集并通过统计分析,最终总结出不同浓度倍数人工脑脊液以及不同浓度的无机盐与葡萄糖对AC L3的趋向活动一般影响规律。研究方法： 1.广州管圆线虫感染宿主模型建立：取洗净的绿叶蔬菜2-3叶置于搪瓷方盘内,完成感染的白玉蜗牛(Achatina fulica)置于蔬菜上。盘内需留置少量蒸馏水,水位以刚刚浸没蔬菜为宜,同时加盖以防白玉蜗牛上爬而影响AC幼虫收获效果。白玉蜗牛室温下自由活动2～4h后,收集方盘内所有液体和粘液以及对方盘内蔬菜表面稍作冲洗的蒸馏水,2500r/min离心5min,去上清；用蒸馏水洗涤沉淀,2500r/min离心5min,重复2次。取沉渣解剖镜下分离3期幼虫。取活力良好的3期幼虫,解剖镜下计数后分装。所获幼虫用三蒸水洗涤两次。以其中每只100条广州管圆线虫感染期幼虫感染大鼠,成功建立广州管圆线虫感染大鼠动物模型并建立实验室AC感染循环。 2.趋向实验的实施：取离心后重悬的ACL320～30μ1置趋化平皿的中心,室温避光孵化8小时后,在解剖镜下计数试验区与对照区内的幼虫(缓冲区的幼虫不计入)。为避免操作误差,每种浓度的溶液平行做3个趋化平皿。为便于镜下准确计数,于平皿底部放置一张小方格纸片,每个平板幼虫计数三次,取其平均值。 3.趋化指数(chemotaxis index, C.I.)的计算：趋化指数是一项描述线虫在不同外在环境因素的影响下趋势活动程度的常用衡量指标。若C.I.∈(0,1],表示相较于三蒸水,溶液区该浓度溶液对AC L3具有吸引作用；若C.I.∈[-1,0),则表示相较于三蒸水,溶液区该浓度溶液对AC L3具有趋避作用；若C.I.=0,表示AC L3在作随机自由活动,溶液区和三蒸水区均无特异性作用。并将C.I.根据下列4个方面进行统计学比较： 1)不同浓度倍数人工脑脊液的趋向活动比较； 2)同一浓度不同无机盐与葡萄糖的趋向活动比较； 3)同一无机盐与葡萄糖溶剂不同浓度的趋向活动比较； 4)按离子作用区分的趋向活动比较。 4.本实验数据均以均值±标准差(X±SD)表示。SPSS19.0统计分析软件包进行各组数据的医学统计。溶液组和三蒸水组的原始实验数据首先进行方差齐性检验,若两组差值服从正态分布(P0.05),则采用配对t检验方法进行统计分析；若两组差值不服从正态分布(P≤0.05),则采用Wilcoxon符号秩和检验方法进行统计分析。显著性水平为P≤0.05。结果： 1.5倍ACSF溶液对AC L3有吸引作用。 2.按浓度区分：在1.0cm范围内,20mMKC1、Na2HPO4、NaHCO3、MgCl2等溶液对AC L3有吸引作用；50mM NaCl溶液对AC L3有吸引作用；100mM KCl溶液对AC L3有驱避作用,同浓度的CaCl2溶液对AC L3有吸引作用；150mMNaCl溶液对AC L3有驱避作用,该浓度的KC1、NaHCO3、MgCl2溶液对AC L3有吸引作用。 3.按溶剂区分：在1.0cm范围内,KCl溶液在20mM、150mM浓度时有吸引作用,在100mM浓度时有驱避作用；NaCl溶液在50mM浓度时有吸引作用,150mM浓度时有驱避作用；Na2HPO4溶液在20mmM浓度时有吸引作用；NaHCO3溶液在20mM、150mM浓度时有吸引作用；CaCl2溶液在100mM浓度时有吸引作用；MgCl2溶液在20mmM、150mM浓度时有吸引作用。 4.按离子作用区分：在1.0cm范围内,K+离子溶液在20mM、150mM浓度时有吸引作用,在100mM浓度时有驱避作用；Na+离子溶液在40mM、50mM浓度时有吸引作用；Cl-离子溶液在200mM浓度时有吸引作用。结论： 1. ACSF溶液对广州管圆线虫三期幼虫具有一定的趋化作用,并且与ACSF溶液的浓度相关。 2. NaCl、Na2HPO4、KCl等无机盐对广州管圆线虫三期幼虫具有一定的趋化作用,并且与无机盐的浓度相关。 3.Na+离子对广州管圆线虫三期幼虫具有一定的趋化作用,并且与Na+离子的浓度相关。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R383.19

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