表皮葡萄球菌组氨酸激酶YycG小分子抑制剂衍生物活性及作用机制的研究

发布时间：2018-04-12 17:45

本文选题：表皮葡萄球菌 + 生物膜　；参考：《复旦大学》2010年硕士论文

【摘要】：凝固酶阴性的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)为人体皮肤表面常见的共生菌,通常不致病。但近年来随着各种植入性医疗材料的广泛使用,表皮葡萄球菌已成为院内感染的主要条件致病菌,主要原因是其能在这些医疗材料表面形成生物膜(biofilm,BF)样结构,该结构能够更好地保护细菌抵抗抗生素的治疗和人体免疫系统的攻击并从中不断释放细菌,从而造成机体的反复感染,最终不得不将被污染的植入性医疗材料通过外科手术摘除,对患者造成极大的痛苦和巨大的经济损失。此外,由于抗生素的大量使用导致表皮葡萄球菌多重耐药株(multi-drug resistant strains)的发生率日趋增高,急需开发新型的抗葡萄球菌感染的药物,尤其是能有效杀伤生物膜包被细菌的抗生素。本课题建立在本实验室已发现针对表皮葡萄球菌YycFG双组分信号转导系统组氨酸激酶YycG小分子抑制剂的基础上,具体工作内容分三部分：第一部分通过与南京工业大学合作,对小分子抑制剂Compound 2和Compound 5进行结构改造,检测衍生物抗菌杀菌活性；第二部分检测衍生物对早期生物膜进一步形成的抑制活性及对成熟生物膜内细菌的杀伤作用；第三部分初步研究了衍生物与表皮葡萄球菌组氨酸激酶的相互作用机制,并检测了衍生物细胞毒性和溶血性。第一部分表皮葡萄球菌YycG小分子抑制剂改造及衍生物抗菌活性的研究细菌的双组分信号转导系统广泛存在于革兰阳性和阴性细菌中,参与调控很多重要的生理功能,并且与很多病原菌的毒力和致病性密切相关,因而被认为是潜在的药物靶标。实验室运用生物信息学分析在表皮葡萄球菌全基因组中共发现了16对双组分信号转导系统,功能预测分析发现大部分双组分信号转导系统参与调控细菌离子交换、胞外蛋白分泌、黏附和自溶等重要的生理功能,其中有两对双组分信号转导系统YycG/YycF和YhcS/YhcR调控细菌生长。以组氨酸激酶YycG的保守功能域HATPase_c为靶标,计算机模拟重建其功能域的三维结构并在此基础上运用高通量虚拟筛选技术,随后通过生物学实验验证,发现5个小分子抑制物(先导化合物)。本研究在YycG组氨酸激酶小分子抑制剂Compound 2 5的基础之上,与南京工业大学的合作,通过药物化学分子设计原理对化合物优化改造,将活性基团拼接原理应用于药物分子的设计合成。基于对双组分信号转导系统的了解和对靶蛋白YycG组氨酸激酶功能域的结构分析,对筛选出的先导化合物原型和活性基团进行相关的分析之后,通过适当的化学反应将已知的作用于不同靶点且对药物分子活性有重要影响的基团或化合物片段进行合理拼接,在保留药理活性化合物噻唑烷酮母核的基础上,设计并引入一系列活性片段,产生活性更高、作用更广泛或毒性更低的新化合物实体(new chemical entities, NCE)。合成了相关关键活性基团变化的衍生物共81个(Compound 2衍生物46个,Compound 5衍生物35个)并完成该系列衍生物分离纯化及其理化性质表征。继而通过对化合衍生物进行活性筛选,确定衍生物的药理活性,并依据生物学活性结果,开展进一步的优化改造和活性筛选。抗菌试验结果显示,81个衍生物中13个具有较好抑菌杀菌活性：Compound2的衍生物H2-10、H2-12、H2-20、H2-27、H2-28、H2-29和H2-30; Compound5的衍生物H5-10、H5-13、H5-22、H5-23、H5-24、H5-25。其中H2-28的MIC浓度达到3.125μM,H2-27和H2-29的MIC浓度也达到6.25μM,均优于原型(Compound 2的MIC为50μM)。Compound 5的衍生物H5-10的MIC浓度也达到3.125μM,优于原型(Compound 5的MIC为6.25μM)。并分别检测了Compound 2和Compound 5衍生物对浮游细菌的杀伤能力,发现衍生物的最小杀菌浓度(MBC)同样优于原型(Compound 2和Compound 5)。第二部分表皮葡萄球菌YycG小分子抑制剂衍生物抗生物膜活性的研究生物膜能够增强细菌对药物的抵抗能力,本研究在证实衍生物能有效抑制及杀伤浮游细菌的基础上,进一步检测了衍生物对早期生物膜进一步形成的抑制作用以及对成熟生物膜内细菌的杀伤作用。首先检测衍生物对早期生物膜(6h生物膜)进一步形成的抑制作用,发现衍生物均能抑制表皮葡萄球菌生物膜的进一步形成(抑制生物膜形成的最低有效药物浓度范围在12.5～100μM),其中抑制生物膜活性最好为Compound 2衍生物H2-20、H2-28、H2-29在12.5μM浓度就能完全抑制生物膜形成,抑制生物膜活性优于原型(100μM)。检测衍生物对成熟生物膜(24h生物膜)的影响,首先观察了衍生物对于24h生物膜肉眼形态的影响,实验显示生物膜形态无变化,但Live-Dead染色后激光共聚焦显微镜观察,发现生物膜内的细菌均被衍生物能杀伤,且衍生物对生物膜内的细菌的杀伤效果明显优于万古霉素,也明显优于原型。第三部分表皮葡萄球菌YycG小分子抑制剂衍生物抑制YycG蛋白酶活性研究通过生物学实验,发现衍生物具有良好的抑菌杀菌活性,且能够抑制早期生物膜的形成及杀伤成熟生物膜内的细菌,活性均优于原型Compound 2和Compound 5。原型均以表皮葡萄球菌YycFG双组分信号转导系统组氨酸激酶YycG蛋白的保守功能域HATPase_c为靶标。衍生物是基于对靶蛋白YycG组氨酸激酶功能域的结构分析,对筛选出的先导化合物原型和活性基团进行相关的分析之后,通过适当的化学反应将已知的作用于不同靶点且对药物分子活性有重要影响的基团或化合物片段进行合理拼接,在保留药理活性化合物噻唑烷酮母核的基础上,设计并引入一系列活性片段而产生的新化合物,其靶标依然是组氨酸激酶YycG蛋白的保守功能域HATPase_c。通过体外磷酸化抑制实验,证实衍生物能不同程度的抑制靶蛋白的磷酸化活性(半数抑制率浓度IC50值范围在22.15～88.35μM),说明小分子抑制物衍生物的靶标依然是组氨酸激酶YycG的保守功能域HATPase_c。为研究YycG抑制剂衍生物如何与靶标相互作用而发挥抑菌杀菌作用的机制,需分析衍生物与YycG蛋白相互作用的氨基酸位点。其具体途径有两个：1,通过化合物对细菌的压力筛选,得到耐药株,然后对耐药株编码YycG蛋白的保守功能域HATPase_c的基因片段进行测序,寻找的突变氨基酸位点；2,通过分子生物学和生物信息学方法对YycG蛋白的保守功能域HATPase_c与化合物的作用位点进行预测,对关键氨基酸位点进行点突变后表达蛋白,检测小分子化合物对蛋白磷酸化活性抑制作用的变化,从而从分子水平上阐明小分子化合物的作用机制。此外,我们研究了小分子抑制剂衍生物的细胞毒性和溶血活性。实验结果显示这些小分子抑制物衍生物在MIC浓度和最高检测浓度(200μM)对哺乳动物细胞(Vero细胞)均无细胞毒性(MTT法),而原型Compound 2对哺乳动物细胞(Vero细胞)有细胞毒性(其IC50值为96μM),说明化合物结构改造后毒性降低。同时检测了小分子抑制剂衍生物对健康人红细胞的溶血活性,在MIC浓度所有衍生物均无溶血,在四倍MIC浓度时也仅有H2-10有轻微溶血,甚至在最高检测浓度200μM, H2-20、H2-27、H2-28及H2-30的溶血作用仍然低于1%,说明结构改造获得的衍生物溶血性进一步降低。以上结果显示,通过对YycG小分子抑制剂的活性集团进行优化改进后,得到的衍生物抑菌杀菌活性、抑制生物膜形成和杀伤生物膜内细菌能力明显更强,同时细胞毒性和溶血活性下降,其靶标依然是YycG蛋白的保守功能域HATPase_c。本研究对研发应用于临床的药物具有重要意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378.1

【共引文献】