可溶性DC-SIGN免疫功能的初步研究

发布时间：2018-04-13 21:09

本文选题：可溶性DC-SIGN + 结合　；参考：《南方医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：天然免疫又称为固有免疫,是机体与生俱有的抵抗体外病原体侵袭、清除体内抗原性异物的一系列防御能力。天然免疫的识别和调控机制是近年来免疫学研究的一个重要热点领域,主要是研究抗原提呈细胞包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞以及天然免疫细胞如NK细胞、粒细胞等如何识别病毒、细菌等病原体感染以及随后触发免疫与炎症的过程和相应的调控方式和效果。其中树突状细胞作为重要的抗原提呈细胞发挥着非常重要的作用,链接了天然免疫和适应性免疫。树突状细胞通过其表面特异的模式识别分子特异的识别病原体相关分子模式,再对病原体进行加工后将抗原信息递呈给T细胞,诱导特异性免疫反应。树突状细胞特异性的结合细胞间黏附分子3的非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule3-grabbing nonintegrin, DC-SIGN, CD209)是树突状细胞表面的一个模式识别分子,属于C型凝集素家族成员,DC-SIGN肽链由糖识别域(carbohydrate recognition domain, CRD)、颈区、跨膜区和胞浆区等4个结构域组成,其天然配体为含甘露糖或岩藻糖的寡糖等,故可识别多种内源性和外源性配体,如ICAM-3、ICAM-2、几种Lewis糖基及细菌、真菌、病毒、寄生虫等。DC-SIGN主要表达在外周组织中未成熟和淋巴组织中的成熟的DC表面,此外,在淋巴结、脾脏、扁桃体等T细胞聚集的区域也检测到了DC-SIGN的表达,在皮肤的真皮层中的树突状细胞也能表达DC-SIGN,还有如子宫、宫颈等粘膜组织和胎盘组织中的巨噬细胞表面也发现有DC-SIGN表达。 DC-SIGN是近年新发现的一种参与机体免疫反应的凝集素受体分子,同SP-A、SP-D、MBL一样都属于C型凝集素家族。SP-A、SP-D能够与免疫细胞如PMN、DC、T细胞结合参与免疫应答,如上调吞噬细胞的表面受体表达,抑制PHA、ConA以及anti-CD3抗体对人单个核细胞的激活。DC-SIGN同样可以与多种病毒如登革热病毒、巨细胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒等包膜上的糖蛋白结合,由于这些蛋白的糖基化水平不同,所以与DC-SIGN的结合力不同,导致病毒感染靶细胞的能力不同。然而有些病毒如水泡型口炎病毒的表面也表达了糖基化蛋白却不与DC-SIGN结合,说明DC-SIGN与糖蛋白结合是有一定特异性的。DC-SIGN既可以帮助树突状细胞捕获抗原、粘附、迁移和成熟,然后启动T细胞的初始免疫应答,又可以与肿瘤细胞或病菌结合并释放相关因子抑制树突状细胞成熟,从而影响了T细胞的活化而使肿瘤细胞或病菌逃避免疫监视。然而研究发现DC-SIGN不仅以膜表面蛋白的形式存在,还有另一种形式即可溶性DC-SIGN (Soluble DC-SIGN, sDC-SIGN).2011年,Plazolles等报道,人体液中存在sDC-SIGN,炎症可刺激其释放,如类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)病人体液中sDC-SIGN浓度升高,sDC-SIGN可促进CMV感染DC。因此,sDC-SIGN的存在已确证无疑。近年来本课题组也针对sDC-SIGN做了相关研究,前期工作已经从健康产妇的胎盘中提取了总RNA,然后通过克隆DC-SIGN编码区基因构建了重组表达载体pET-41a-sDC-SIGN,成功建立了融合蛋白sDC-SIGN-GST的表达体系。在对sDC-SIGN-GST研究中发现,以Con A,或anti-CD3/CD28刺激纯化T细胞后,sDC-SIGN可抑制其活化标志CD69表达、细胞增殖及分泌细胞因子IFN-γ、IL-10和IL-17A,但促进IL-6分泌。这些发现提示,sDC-SIGN可能对T细胞的活化、增殖、分化(向各功能亚群)等各个方面都具有直接的调节作用。本课题组成员对表达载体pET-41a-sDC-SIGN还进行了优化,去掉了GST标签,构建了新的表达载体pET-17b-sDC-SIGN,成功表达出无任何标签蛋白的sDC-SIGN。在此基础上,本实验对sDC-SIGN的功能进行了相关研究,并利用抗人sDC-SIGN单克隆抗体1C6和兔多抗建立了双夹心检测体系,对收集的普通人的血清样本中sDC-SIGN含量进行了检测。第一章sDC-SIGN蛋白的表达、纯化及其功能的初步研究本课题组在前期已经构建了无标签蛋白sDC-SIGN的表达载体pET-17b-sDC-SIGN,为了对其进行功能研究,首先要制备sDC-SIGN蛋白。我们将重组表达载体pET-17b-sDC-SIGN转入BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,然后进行SDS-PAGE分析,确认蛋白表达后对其进行复性。由于原核表达的蛋白中还含有杂蛋白,因此我们利用本课题组前期工作中制备的抗人sDC-SIGN单克隆抗体1C6制作了sepharose4B亲和层析柱纯化了蛋白,并且对纯化蛋白进行了Western-Blot和ELISA鉴定,确认了该蛋白即目的蛋白,并且纯度较高。最后为了确认原核表达的蛋白具有生物学活性,我们通过ELISA检测了sDC-SIGN与甘露糖的结合功能,结果显示蛋白的生物学活性较好。研究发现膜型DC-SIGN在免疫应答中发挥着重要的作用,参与DC与未活化T细胞的接触并激活T细胞。那么DC-SIGN是否也参与免疫应答呢?我们用原核表达的sDC-SIGN进行了探索性研究。将生物素标记的sDC-SIGN Jurkat细胞和T细胞共孵育后检测蛋白与细胞的结合,通过荧光显微镜观察和流式细胞术检测都发现sDC-SIGN能够与Jurkat细胞和T细胞结合。在研究过程中我们还发现sDC-SIGN能够抑制人T细胞系Jurkat细胞和anti-CD3/CD28刺激活化的T细胞的生长状态：Jurkat细胞和活化的T细胞生长是呈聚团状的,但是在加入sDC-SIGN后两种细胞的细胞团都明显变小了,sDC-SIGN抑制了细胞的聚团,即抑制了细胞之间的粘附。由于前期工作中发现sDC-SIGN能够抑制活化T细胞的增殖以及细胞因子IFN-γ IL-10和IL-17A的分泌,于是我们探索了sDC-SIGN是否对T细胞信号有影响,结果发现sDC-SIGN抑制了T细胞TCR信号通路的信号传导,ZAP-70、LCK、NK-κB的磷酸化水平明显减弱。说明sDC-SIGN能够抑制T细胞信号传导进而影响T细胞的相关功能而调节免疫反应。 DC-SIGN的配体包括多种病原体糖类抗原,如甘露聚糖、岩藻糖等,因此我们检测了sDC-SIGN与病原体糖类抗原的结合。通过ELISA检测sDC-SIGN与LTA、LPS和Poly (I:C)的结合,发现原核表达的sDC-SIGN能够与LTA和Poly(I：C)结合。LTA是来自金黄色葡萄球菌的磷壁酸,于是我们用ELISA检测了sDC-SIGN与金黄色葡萄球菌的结合,结果显示sDC-SIGN与金黄色葡萄球菌存在浓度依赖性的结合,而且这种结合能够被甘露糖和LTA阻断。实验还发现sDC-SIGN与金黄色葡萄球菌的结合还与Ca2+浓度相关,Ca2+浓度越高结合越强。有研究报道未成熟DC能够吞噬金黄色葡萄球菌,因此我们探索了sDC-SIGN是否会影响imDC对金葡菌的吞噬,结果发现sDC-SIGN能够抑制未成熟DC吞噬金黄色葡萄球菌。第二章sDC-SIGN双夹心ELISA检测体系的建立及初步应用通过给小鼠腹腔注射分泌抗人sDC-SIGN单克隆抗体细胞株,得到含有抗sDC-SIGN单克隆抗体的腹水,采用辛酸-硫酸铵沉淀法对腹水进行纯化提取单抗,经过SDS-PAGE鉴定发现抗体中依然含有杂志蛋白。由于该方法是对抗体进行粗提,所以再次用Protein G柱纯化抗体。在经过Protein G柱纯化抗体后再次SDS-PAGE鉴定,结果显示该抗体制剂较纯。为了获得灵敏度高的ELISA检测体系,我们对单抗进行了生物素标记。我们准备的抗体有抗人sDC-SIGN兔多抗、单抗1C6和单抗4H3,通过棋盘滴定法筛选出了捕获抗体兔多抗和检测抗体Biotin-1C6以及抗体的最佳工作浓度5μg/ml和1μg/ml。并且比较了商品化anti-CD209与Biotin-1C6作为检测抗体的灵敏度和特异性,发现Biotin-1C6的灵敏度和特异性并不比商品化anti-CD209弱。然后用纯化的原核表达sDC-SIGN建立标准曲线,回归方程为Y=356.5X2+33.16X-10.49, R2=0.996,线性范围在0-200ng/ml之间,能基本满足血清样本检测的需要。于是我们用建立好的ELISA检测体系对收集的人群血清样本进行了检测。经过标准曲线的方程转化后采用非配对T检验比较发现普通人群中男性血清样本的sDC-SIGN浓度均数低于女性的血清样本中sDC-SIGN均数,P0.05,有明显差异；并且普通人群中小于30岁的人的样本血清中sDC-SIGN均数高于大于40岁的人的血清样本中sDC-SIGN均数,P0.05。结果提示,sDC-SIGN的血清含量在不同人群中是存在差异的。
[Abstract]:Natural immunity is also known as innate immunity . It is a series of defense - resistant ability to resist in vitro pathogen invasion and removal of antigenic foreign body in vivo . The recognition and control mechanism of innate immunity is an important hot spot in immunology research in recent years .

DC - SIGN ( DC - SIGN , CD209 ) is a pattern recognition molecule on the surface of dendritic cells . DC - SIGN is a member of C - type lectin family .

DC - SIGN binds to immune cells such as PMN , DC and T cells .

In recent years , the expression vector pET - 41a - sDC - SIGN ( sDC - SIGN ) has been optimized . The expression vector pET - 41a - sDC - SIGN ( sDC - SIGN ) has been successfully constructed .

first chapter , the expression , purification and function of sdc - SIGN protein

The recombinant expression vector pET - 17b - sDC - SIGN was transformed into BL21 ( DE3 ) competent cells to induce the expression . Western - Blot and ELISA were used to identify the protein .

It was found that sDC - SIGN inhibited the proliferation of T cells and the secretion of cytokines IFN - 纬IL - 10 and IL - 17A . The results showed that sDC - SIGN inhibited T cell proliferation and the secretion of cytokines IFN - 纬IL - 10 and IL - 17A .

The binding of sDC - SIGN to Staphylococcus aureus was detected by ELISA . The results showed that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results showed that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results show that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results show that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus . The results show that sDC - SIGN binds to Staphylococcus aureus .

Chapter II Establishment and Preliminary Application of sDC - SIGN Double Sandwich ELISA Detection System

A monoclonal antibody against sDC - SIGN was obtained by intraperitoneal injection of monoclonal antibody against human sDC - SIGN . The monoclonal antibody against sDC - SIGN was purified and purified . The antibody was purified by SDS - PAGE . The results showed that the sensitivity and specificity of the antibody were 5 渭g / ml and 1 渭g / ml .
The mean number of sDC - SIGN in serum samples of patients less than 30 years old in general population was higher than that of sDC - SIGN in serum samples of those aged above 40 years , P 0.05 . The results suggested that the serum levels of sDC - SIGN were different among different populations .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【参考文献】