日本脑炎病毒核酸疫苗的构建及免疫原性研究

发布时间：2018-04-13 21:56

  本文选题：DNA疫苗 + 日本脑炎病毒　； 参考：《第三军医大学》2010年博士论文

【摘要】： 日本脑炎病毒(Japaneses encephalitis virus, JEV)又称乙型脑炎病毒,属黄病毒家族,经蚊虫叮咬传播,引起人类流行性乙型脑炎(简称乙脑)。目前乙脑主要流行于东南亚各国和远东地区,每年约45 000人发病,其中10 000人死亡。JEV感染后往往引发严重的中枢神经系统症状,死亡率较高,幸存者亦有半数以上发展为永久的神经系统后遗症。乙脑尚无有效的治疗手段,因此免疫接种是控制其流行、保护易感人群的重要措施,目前使用的JEV疫苗主要是几种灭活疫苗和SA14-14-2减毒活疫苗。虽然疫苗的使用显著降低了乙脑的发病率,但上述疫苗均有一定局限性:灭活疫苗存在高生产成本、免疫力不持久、需多次注射及存在变态反应等缺陷;而减毒活疫苗则存在毒力回复的危险。特别是2006年我国山西运城出现乙脑流行,报告成人乙脑病例66例,其中死亡19例;并且2005-2007年期间印度亦持续发生乙脑的大规模流行,因此亟待发展一种安全、有效、质优价廉的新型JEV疫苗,而核酸DNA疫苗是一个极具潜力的发展方向。 黄病毒基因组为单股正链RNA病毒,约为11 kb,仅有一个开放阅读框(open reading frame, ORF ),从5’到3’端依次编码3个结构蛋白(C、prM和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。在这些蛋白中,以E蛋白可诱生中和抗体(neutralization antibody)而最为重要;prM蛋白在病毒成熟过程中会被酶切为M蛋白,某些情况下,这一酶切并不完全,从而使prM蛋白成为潜在的中和抗体位点,并且E蛋白的正确折叠亦离不开prM蛋白;NS1蛋白则是借助抗体依赖性补体介导的途径发挥保护作用。当前的研究已经证实将表达prM-E/E或NS1的质粒免疫小鼠后,能够诱导特异性的保护免疫;并且小鼠被动免疫针对prM、E或NS1蛋白的单克隆抗体后亦能保护小鼠免受致死量病毒的攻击。因此,为进一步提高JEV核酸疫苗的免疫效果,构建核酸疫苗时同时表达prM-E-NS1蛋白,综合三者的保护性表位,不失为一个理想的选择。 但是单纯的DNA疫苗尚不足以引发良好的免疫效果,需要借助佐剂,特别是近年来广泛使用的细胞因子佐剂,即在基因水平将细胞因子与核酸疫苗共同表达,利用细胞因子上调机体免疫水平的作用,进而增强核酸疫苗的效果。特别是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)因其具有可促进巨噬细胞及树突细胞(dendritic cell,DC)的浸润、成熟和活化,进而提高免疫系统的抗原提呈能力,增加疫苗的免疫原性等优点而得到了广泛关注,目前GM-CSF已被证实是良好的基因佐剂。 目前来源于脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus ,EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site ,IRES)序列已经广泛应用于异源基因的共表达,因此本研究采用同样的策略,构建了双顺反子表达载体pCAG-JEGM,在同一载体内共表达JEV prM-E-NS1片段和GM-CSF基因,两者由IRES相连。同时亦构建了单独表达prM-E-NS1的质粒pCAG-JE和单独表达GM-CSF的质粒pCAG-GM,以评价GM-CSF不同的免疫方式引起免疫反应的异同。实验流程、结果及结论如下: 1.质粒构建 JEV Beijing-1株感染C6/36细胞,提取病毒RNA;同时提取小鼠脾脏总RNA,分别以病毒RNA和脾脏RNA为模板,RT-PCR扩增,得到JEV prM-E-NS1片段和GM-CSF片段后,将该两片段分别插入pIRES质粒的多克隆位点A(multiple cloning sites A,MCSA)和多克隆位点B(multiple cloning sites B,MCSB),阳性克隆命名为pIRES-JEGM。进而经Xho I和Not I双酶切该质粒得到prM-E-NS1-IRES-GM-CSF片段后,将其克隆入具有鸡β-actin启动子的pCAGGSP7质粒的相应位点,阳性克隆经酶切和测序验证,命名为pCAG-JEGM。为进一步评价pCAG-JEGM的保护性效果,本研究继续构建了pCAG-JE (仅表达JEV prM-E-NS1)和pCAG-GM (仅表达GM-CSF)质粒。为了避免不同质粒之间引起机体反应性不同及表达效率的差异,该两个质粒的构建同样使用了pCAGGSP7质粒。上述质粒经测序和转染实验验证构建正确,可用于下一步的动物实验。 2.动物免疫 大量抽提各种质粒后,免疫6-8周龄BALB/c小鼠,分为5组,分别免疫pCAG-JEGM、pCAG-JE、pCAG-JE+pCAG-GM、pCAG-JE+pCAGGSP7和pCAGGSP7,其中免疫pCAGGSP7作为对照组,免疫剂量为100μg/次/只,间隔3周,共免疫3次。末次免疫后3周,部分小鼠处死,用于检测免疫学指标;部分小鼠则以50 LD50病毒量腹腔攻毒,进行保护性实验。 3.抗体检测 BALB/c小鼠于免疫前一天断尾取血,并在每次加强免疫前取血,分离血清后-80℃冻存;大量增殖病毒并浓缩病毒抗原用以包被96孔板,进行ELISA测定。首先监测免疫期间,小鼠在不同的时相点针对病毒抗原的免疫应答产生情况,所有的血清均以1:100稀释,测定492nm处OD值,结果显示:pCAGGSP7免疫组血清在观察期间一直处于低水平,加强免疫后,其抗体水平未发生任何变化,与预期相符;而pCAG-JEGM、pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7三个免疫组在第一次免疫后3周,即可检测到明显的抗体反应,并且免疫反应随着第二、三次加强免疫而进一步升高;然而矛盾的是,pCAG-JE+pCAG-GM共同免疫组则未有明显的抗体产生,即便经两次加强免疫,其抗体水平亦无明显变化,与其他三个免疫组相比,差别显著(p 0.00001)。 同时末次免疫后,处死小鼠,分离血清,同样以ELISA的方法测定各组anti-JEV IgG抗体滴度,结果显示:pCAG-JEGM免疫组抗体滴度最高1:2 900,而pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7免疫组抗体滴度大致相当,分别为1:1 300和1:1 600;然而pCAG-JE+pCAG-GM免疫组仅显示了极低的抗体滴度(1:130),说明该组病毒抗原的表达受到了明显的抑制。进而继续用ELISA的方法检测了免疫血清的IgG抗体亚型,各组免疫血清显示了相近的IgG1和IgG2a水平。攻毒后各组抗体效价明显升高:pCAG-JEGM组为1:25 600,pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7为1:12 800,pCAG-JE+pCAG-GM组亦达到了1: 6 400;并且攻毒后血清IgG亚型以IgG1升高为主,提示攻毒后免疫反应以Th2型为主。 4.中和试验 一般认为E蛋白抗体特别是其中和抗体,在JEV感染过程中,发挥主要的保护作用,因此本研究检测了小鼠攻毒前后中和抗体的产生情况。结果显示:攻毒前各组仅显示了极低的中和抗体效价,pCAG-JEGM和pCAG-JE组中和抗体效价为1:20;pCAG-JE+pCAG-GM和pCAG-JE+pCAGGSP7组中和抗体效价为1:10;pCAGGSP7空质粒对照组中和抗体效价1:10;各组均未产生明显的的中和抗体,说明针对候选核酸疫苗并未产生无菌免疫(sterile immunity)。而攻毒后,各组中和抗体效价显著升高, pCAG-JEGM组为1:390,pCAG-JE组和pCAG-JE+pCAGGSP7相近,分别为1:260和1:290; pCAG-JE+pCAG-GM为1:130,提示记忆性B细胞的激活引起抗体滴度迅速升高。 5. NS1抗体依赖性补体介导的细胞毒作用 本研究除检测E蛋白诱导的中和抗体水平外,亦检测了NS1抗体介导的溶细胞作用。以JEV感染的L929细胞作为靶细胞,各组小鼠免疫血清经56℃灭活补体,在体外与豚鼠补体按照不同的稀释度和比例混合,37℃孵育1h后,接种至靶细胞中,孵育4h后,检测上清中的LDH释放。同时本研究还以pCAG-ME质粒(仅表达JEV prM-E蛋白)的免疫血清做平行对照。结果显示, pCAG-JEGM、pCAG-JE和pCAG-JE+pCAGGSP7组显示了≥50%的溶细胞活性,而pCAG-JE+pCAG-GM的溶细胞活性明显低于上述三组,仅32%,与对照组相近,pCAG-ME和对照血清组仅显示了非特异性的溶细胞活性(分别为30%和23%)。 6.淋巴细胞增殖实验和CTL检测 末次免疫后3周处死小鼠,收集脾细胞,体外培养并以病毒抗原进行刺激,结果提示:各免疫组淋巴细胞与pCAGGSP7组相比,均显示了一定的细胞增殖,刺激指数(SI)介于2.5-2.8之间,而pCAGGSP7组SI仅为1.09。进一步实验中以病毒感染的L929细胞作为靶细胞,体外经病毒抗原刺激后的脾细胞作为效应细胞,进行CTL测定,结果仅显示极低的CTL活性,说明在JEV感染过程中,CTL可能并不发挥主要的保护作用。 7.小鼠保护性实验 各组小鼠均在末次免疫后3周,腹腔攻毒。pCAGGSP7对照组小鼠全部死亡,攻毒剂量为50 LD50时,pCAG-JEGM组、pCAG-JE组及pCAG-JE+pCAGGSP7组小鼠全部存活,而pCAG-JE+pCAG-GM组则未能达到全部保护,其保护率为71.4%(5/7),提示病毒抗原质粒与GM-CSF质粒共同免疫时,不仅抑制了免疫应答,同时亦降低了动物保护作用。 8.过继性转移(被动免疫) pCAG-JEGM和pCAG-JE组攻毒前血清和攻毒后血清分别腹腔接种于2-3周龄BALB/c小鼠,24h后以20 LD50 JEV攻毒,结果显示,对照组小鼠全部死亡,接种pCAG-JEGM攻毒前血清(pCAG-JEGM-pre)未对小鼠产生保护作用,接种pCAG-JE攻毒前血清组(pCAG-JE)仅一只小鼠存活;而接种攻毒后血清,两组小鼠全部存活。同时考虑攻毒前并未检测到明显的CTL活性,过继性转移实验进一步说明攻毒后小鼠免疫系统产生的大量记忆性抗体(anamnestic antibody)特别是大量的中和抗体,在JEV感染保护机制中发挥了主要作用。 综上所述,GM-CSF的不同免疫方式引起的免疫反应不同:GM-CSF与病毒抗原同时表达时,能促进JEV的抗体的产生;而将两者分别构建在不同的质粒上,混合后免疫小鼠时,则会抑制免疫反应进而降低针对JEV的保护率。本研究的实验结果说明GM-CSF与目的抗原时空表达的差异会影响免疫应答的产生,GM-CSF具有一定的佐剂作用,但是使用时仍需谨慎。
[Abstract]:Japanese encephalitis virus ( JEV ) , also known as Japanese encephalitis virus ( JEV ) , belongs to the family of yellow virus , and is transmitted by mosquito bite to cause epidemic encephalitis B .



The genome of the Yellow virus is a single - strand positive - strand RNA virus , about 11 kb , only one open reading frame ( ORF ) , which encodes three structural proteins ( C , prM and E ) and seven non - structural proteins ( NSAs , NS2A , NS2B , NS3 , NS4A , NS4B , and NS5 ) from the 5 ' to 3 ' end . In order to further improve the immune effect of JEV nucleic acid vaccine , prM - E / E or NS protein can be used to protect mice from lethal virus .



However , the simple DNA vaccine is not enough to induce a good immune effect . It is necessary to use adjuvant , especially the cytokine adjuvant widely used in recent years , that is , the cytokine is co - expressed with nucleic acid vaccine at the gene level , and the effect of nucleic acid vaccine is enhanced . In particular , granulocyte - macrophage colony - stimulating factor ( GM - CSF ) has gained wide attention because it has the advantages of promoting infiltration , maturation and activation of macrophages and dendritic cells ( DC ) , increasing the immunogenicity of the vaccine and the like , and at present , GM - CSF has been proved to be a good gene adjuvant .



At present , the sequence of internal ribosome entry site ( ECCV ) derived from encephalomyositis virus ( EMCV ) has been widely used in the co - expression of heterologous genes . Therefore , the same strategy has been used to construct pCAG - JEGM of double cis - trans - expression vector pCAG - JEGM . The plasmid pCAG - JE separately expressing prM - E - NS and the plasmid pCAG - GM expressing GM - CSF were constructed . The results and conclusions were as follows :



1.Construction of Plasmid



In order to avoid the difference of pCAGGSP7 plasmid , pCAG - JE ( only expressed by JEV prM - E - NS ) and pCAG - GM ( only GM - CSF ) was obtained .



2 . Animal immunity



BALB / c mice were immunized with pCAGGSP7 ( pCAG - JEGM , pCAG - JE , pCAG - JE + pCAG - GM , pCAG - JE + pCAGGSP7 and pCAGGSP7 , respectively ) .



3 . Antibody detection



The serum levels of pCAG - JE + pCAG - JE and pCAG - JE + pCAGGSP7 did not change significantly after the first immunization . The results showed that pCAG - JE + pCAG - JE and pCAG - JE + pCAGGSP7 had no obvious antibody production .



The titer of anti - JEV IgG antibody was determined by ELISA . The results showed that the antibody titer of pCAG - JE and pCAG - JE + pCAGGSP7 was 1 鈭，

本文编号：1746372