体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞方向分化的研究

发布时间：2018-04-15 08:26

  本文选题：骨髓间充质干细胞 + 褪黑素　； 参考：《江苏大学》2009年硕士论文

【摘要】： 目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells,MSCs)经分离纯化、体外培养后,以褪黑激素(Melatonin,MT)、嗅鞘细胞(OlfactoryEnsheathing Cells,OECs)上清液诱导MSCs向神经元样细胞分化的情况。探讨MT体外诱导MSCs不同时段向神经样细胞分化的情况,以及MT、OECs上清液联合诱导的优劣,找出二者最优诱导方案。为更好的研究MSCs向神经元样细胞分化提供一定的实验基础,为细胞移植提供又一类种子细胞。 方法在无菌条件下,取健康雄性SD大鼠的骨髓组织,用密度为1.077g/mL的Ficoll人淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取有核细胞层,以5×10~6/cm~2密度接种于25ml细胞培养瓶,用含10%胎牛血清的L-DMEM培养基悬浮细胞,置于37℃含5%CO_2的细胞培养箱中培养。培养48小时后半量换液,弃去不贴壁的细胞。以后每2～3天换液一次,当细胞生长达到90%融合时按1:3行传代培养。(1)取2代MSCs在融合达到90%时,以10 mmol/L的MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经元样细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14d在倒置显微镜下观察细胞形态,以免疫荧光法鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元细胞特异性标志神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。(2)在2代MSCs在融合达到90%时,以10 mmol/L MT及OECs上清液为诱导剂诱导MSCs向神经元样细胞分化,在倒置显微镜下观察细胞形态,在诱导后14天以免疫荧光法鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元细胞特异性标志神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,并使用westernblot法对上述指标进行定量分析。最后统计分析各组间结果有无差异。 结果在诱导前,大鼠MSCs以长梭形为主,有些呈圆形、多角形,少数有短小突起。(1)在以MT诱导3d后,见部分细胞胞体收缩,折光性增强,伸出突起,部分胞体收缩成三角形或成为简单的双极或多极细胞。7d后较长的突起末端形成生长锥样的膨大,呈现神经元样的形态。10d后神经元样细胞数量增多,细胞突起延长。14d后,神经元样的细胞数量进一步增多,且几个细胞的突起之间互相连接成网状。绣导3d细胞开始表达nestin,7～14d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。(2)在以MT及OECs为诱导剂诱导3d后MSCs逐渐向神经元样细胞分化,呈现神经元细胞样形态,在诱导14d后免疫荧光法鉴定NF、NSE均为阳性表达,GFAP为阴性表达。MT及OECs上清液联合诱导组变化较为显著,westernblot法检测亦可证实。 结论(1)MT可诱导MSCs向神经元样细胞分化,分化过程是:MSCs→神经干样细胞→神经元样细胞。(2)MT及OECs上清液可诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞,且二者联合诱导效果优于单独诱导。
[Abstract]:Objective to study the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (Marrow Mesenchymal Stem cells cells) into neuron-like cells induced by melatonin in vitro and olfactory ensheathing cells (OECs) supernatant.To investigate the differentiation of MSCs into neuroblast-like cells in vitro and the advantages and disadvantages of MTOECs supernatant induced by MT in vitro, and to find out the optimal induction scheme.It provides some experimental basis for studying the differentiation of MSCs into neuron-like cells and provides another kind of seed cells for cell transplantation.Methods the bone marrow tissue of healthy male Sprague-Dawley rats was collected under aseptic condition. The nucleated cell layer was obtained by density gradient centrifugation of Ficoll human lymphocyte isolate with density of 1.077g/mL. The nucleated cell layer was seeded into 25ml cell culture flask with a density of 5 脳 10~6/cm~2.Suspension cells were cultured on L-DMEM medium containing 10% fetal bovine serum in 37 鈩，

本文编号：1753336