基因comE对肺炎链球菌转化率影响机制的研究

发布时间：2018-04-17 11:52

  本文选题：肺炎链球菌 + comE　； 参考：《重庆医科大学》2009年硕士论文

【摘要】： 转化是细菌基因重组最常见的方式之一,转化的结果可使细菌的染色体整合上外源DNA,从而使其某些生物学特征发生变化,并能代代遗传。大量研究证明细菌的转化与其进化、毒力因子和耐药性等生物学性状的表达密切相关。同时转化也成为实验室对细菌进行基因改造的一个简便而重要工具。 肺炎链球菌可以在自然生长状态下产生感受态而发生转化,即自然转化;其感受态也可通过感受态刺激因子(competence-stimulating peptide,CSP)诱导产生,即诱导转化。目前调控肺炎链球菌转化的基本分子网络已清楚,但肺炎链球菌在不同生长阶段、不同浓度CSP诱导时的转化率差别很大,其分子机制尚不清楚。操纵子comCDE是调控肺炎链球菌转化发生的关键基因,其中comE为该操纵子发挥作用的效应蛋白,细菌不同转化率的发生是否就是该基因表达变化的直接结果呢?我们的研究思路是:首先缺陷基因comE,以验证基因comE在细菌转化中的关键作用,然后分别探讨CSP诱导转化和自然转化中不同转化率的发生与该基因的相关性,并通过蛋白质组学方法初步探索其调控机制。本研究包括以下三个部分: 1. comE基因对肺炎链球菌转化的影响。构建comE基因缺陷菌株,比较野生菌株和缺陷菌株的自然转化率及CSP诱导转化率,结果显示comE基因缺陷菌株的自然转化率和CSP诱导转化率为0,提示基因comE为细菌自然转化和CSP诱导转化所必需。 2.探讨肺炎链球菌在不同生长时间的自然转化率与comE基因表达变化的相关性。通过荧光定量PCR技术检测comE基因在细菌不同时期的mRNA表达水平,并测定对应的细菌转化率。结果显示细菌在整个生长过程中只有一个转化率高峰,约在菌密度为A550=0.3左右;而基因comE的mRNA表达则有2~3个高峰期,与细菌不同转化率的发生无显著相关性(r0.3),提示可能存在基因comE以外的其他因子与细菌的自然转化率直接相关。 3.探讨不同浓度CSP诱导细菌发生的不同转化率与comE基因表达变化的相关性。通过荧光定量PCR技术检测comE基因在不同浓度CSP诱导时、不同时期的mRNA表达水平,并测定对应的细菌转化率。结果显示(1)comE的mRNA表达水平在100μg/L CSP诱导后10min显著上升,之后迅速下降,其转化率与其comE的基础表达显著相关(r0.99),提示在该CSP浓度下,细菌的不同转化率发生与comE的基础表达量相关。(2)10μg/L、100μg/L和1000μg/L的CSP诱导转化时,细菌的转化率没有随其浓度的增加而升高,comE只在100μg/L的CSP诱导时表达量增加,表明细菌不同转化率发生及comE的诱导表达量变化与CSP不存在明显浓度依赖性,提示存在CSP以外的其他因子调控基因comE的表达及细菌的转化,且可能存在基因comE以外的其他因子与细菌的转化率直接相关。 为了探寻细菌转化可能的调控机制,我们应用蛋白质组学技术(双向电泳结合MALDI-TOF-MS)对肺炎链球菌感受态发生到关闭这一时间段内表达的蛋白质进行比较,从蛋白水平分析了其发生不同转化率的分子机制。结果显示细菌在发生不同转化率时期的蛋白表达谱有一定差异,具体差异尚需进一步研究。
[Abstract]:Transformation is one of the most common ways of bacterial gene recombination , and the results of transformation can make the chromosome of bacteria integrate exogenous DNA , so that some biological characteristics of bacteria can be changed , and the inheritance can be replaced . A large number of researches show that the transformation of bacteria is closely related to the expression of biological characters such as evolution , virulence factors and drug resistance .


The transformation of Streptococcus pneumoniae can be induced by inductive stimulation ( CSP ) , which is the key gene for regulating the transformation of S . pneumoniae . The research thought is : firstly , the gene comE is the key gene for regulating the transformation of Streptococcus pneumoniae .


1 . The effect of comE gene on the transformation of Streptococcus pneumoniae was constructed . The natural conversion and CSP induced transformation rate of comE gene were compared . The results showed that the natural transformation rate and CSP induced transformation rate of comE gene deficient strains were 0 , suggesting that comE was necessary for bacterial natural transformation and CSP induced transformation .


2 . To investigate the correlation between the natural conversion of Streptococcus pneumoniae at different growth times and the expression of comE gene . The mRNA expression level of comE gene in different periods of bacteria was determined by fluorescence quantitative PCR . The results showed that there was only one peak of transformation in the whole growth process , and there was no significant correlation between the expression of gene comE and the transformation rate of bacteria ( r0.3 ) . It was suggested that there might be a direct correlation between the other factors besides comE and the natural conversion rate of bacteria .


3 . The expression level of comE mRNA in different concentrations of CSP was determined by fluorescence quantitative PCR . The results showed that the expression level of comE increased significantly after 10 min after induction of 100 渭g / L CSP . The results showed that the expression of comE and comE increased rapidly after the induction of 100 渭g / L CSP .


In order to explore the possible regulatory mechanism of bacterial transformation , we compared the proteins expressed during the period of closing this time period by using the proteomic technique ( two - dimensional electrophoresis combined with MALDI - TOF - MS ) . The molecular mechanism of different conversion rate was analyzed from the protein level . The results showed that the protein expression profiles of the bacteria in different transformation periods were different , and the specific differences still needed further study .

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R378.14

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