FOXO3a基因在Anoikis中对细胞的保护作用研究

发布时间：2018-04-17 20:51

  本文选题：FOXO3a + Anoikis　； 参考：《浙江大学》2009年博士论文

【摘要】： 目的:探索FOXO3a基因对Anoikis的影响。 方法:自行设计FOXO3a基因的shRNA,构建插入shRNA的LMP逆转录病毒质粒,经过克隆选择后,在phoenix细胞中包装病毒,使用病毒转导shRNA-FOXO3a进入MCF10a,MCF7和MDA-MB-231细胞,经过puromycine选择后建立FOXO3a表达沉默细胞系;使用血清饥饿法诱导FOXO3a的表达,建立了FOXO3a高表达细胞系。利用polyhema迫使细胞处于suspension状态模拟细胞离开细胞外基质的条件,通过测定caspase-3,Annexin V/PI,DNA ladder和Trypanblue staining判断早期,中、晚期细胞凋亡的状态以及死亡细胞的数量。测定细胞内ROS(ReactiveOxygen Species)的水平判断细胞从attachment到suspension ROS的变化,通过补充小剂量的ROS和使用ROS的抑制剂NAC观察细胞凋亡和死亡的状态,使用GSA(Gel Shift Assay)检测FOXO3a是否作为转录因子与MnSOD启动子中的结合域结合调控MnSOD的表达,通过western blot判断MnSOD的表达变化。使用IP(immune-Precipitation)法检测FOXO3a蛋白是否与E-cadherin蛋白相互作用而影响细胞的生存状态,western blot判断E-cadherin的表达。 结果:使用shRNA和血清饥饿法成功的构建了FOXO3a低表达和高表达细胞系。细胞凋亡和死亡的检测结果显示相对于attachment细胞,suspension细胞的凋亡比率和死亡数量明显升高;attachment细胞之间没有显著差异;suspension细胞中,FOXO3a基因沉默细胞凋亡比率和死亡数量明显升高;在血清饥饿诱导FOXO3a表达的suspension细胞中,凋亡指标降低。在MCF10a细胞中,相对于attachment细胞,ROS的水平在suspension细胞中明显下降,在FOXO3a基因沉默的细胞中ROS的含量明显低于对照组,当给予小剂量的ROS,明显改善了suspension细胞的存活,而NAC作为ROS的抑制剂逆转了该现象。GSA结果显示FOXO3a作为转录因子可以与MnSOD启动子结合调控MnSOD的表达,与attachment状态相比,在suspension条件下,MnSOD的表达升高,在FOXO3a基因沉默的细胞中相升高更明显。IP实验证实FOXO3a蛋白可用E-cadherin因子相互作用,E-cadherin的表达在attachment细胞中无明显差异,在suspension细胞中,FOXO3a基因沉默的细胞E-cadherin表达降低。 结论:FOXO3a通过调控MnSOD影响ROS以及与E-cadherin相互反应授予细胞Anoikis抵抗的能力。
[Abstract]:Objective: to explore the effect of FOXO3a gene on Anoikis.Methods: we designed the shRNAs of FOXO3a gene and constructed the LMP retrovirus plasmid inserted into shRNA. After cloning and selection, we packaged the virus in phoenix cells, then transduced shRNA-FOXO3a into MCF10aMCF7 and MDA-MB-231 cells. After puromycine selection, FOXO3a expression silencing cell lines were established.The expression of FOXO3a was induced by serum starvation, and a high expression cell line of FOXO3a was established.The condition of cell leaving extracellular matrix (ECM) was simulated by polyhema. The apoptosis state and the number of dead cells were determined by detecting caspase-3 Annexin V / Pi ladder and Trypanblue staining.The changes of cells from attachment to suspension ROS were determined by measuring the level of intracellular ROS(ReactiveOxygen species.The apoptosis and death of cells were observed by adding small doses of ROS and using NAC, an inhibitor of ROS.GSA(Gel Shift assay was used to detect whether FOXO3a acts as a transcription factor binding to the binding domain of MnSOD promoter to regulate the expression of MnSOD, and western blot was used to determine the change of MnSOD expression.The expression of FOXO3a protein was detected by Western blot in order to determine whether the FOXO3a protein interacted with E-cadherin protein and affected the survival state of the cells.Results: low expression and high expression of FOXO3a were successfully constructed by shRNA and serum starvation.The results of apoptosis and death test showed that there was no significant difference between attachment cells and apoptosis rate and death number of FOXO3a gene silencing cells compared with attachment cells.In suspension cells with FOXO3a expression induced by serum starvation, the apoptotic index was decreased.In MCF10a cells, relative to attachment cells, the level of Ros decreased significantly in suspension cells, and the content of ROS in FOXO3a gene silenced cells was significantly lower than that in the control group. The survival of suspension cells was significantly improved when low dose ros was given.The results showed that FOXO3a, as a transcription factor, could bind to MnSOD promoter to regulate the expression of MnSOD. Compared with attachment, the expression of Mn-SOD in suspension was higher than that in attachment.The results showed that the expression of E-cadherin in attachment cells was not significantly different from that in suspension cells. The expression of E-cadherin was decreased in suspension cells.ConclusionTwo FOXO 3a affects ROS by regulating MnSOD and interacts with E-cadherin to confer the ability of Anoikis resistance in cells.
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R363

【共引文献】

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本文编号：1765251