腺病毒介导基因修饰MSCs抗肿瘤及白血病干细胞研究

发布时间：2018-04-30 02:41

  本文选题：脐带间质干细胞 + 融合基因　； 参考：《江苏大学》2008年硕士论文

【摘要】： 目的构建携带绿色荧光蛋白的TNFa-Tumstatin融合基因腺病毒表达载体(AdGFP/TNFa-Tumstatin),转染人脐带间质干细胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs),研究融合基因TNFa-Tumstatin修饰的hUCMSCs体外通过分泌TNFa-Tumstatin融合蛋白发挥的抗肿瘤效应;本文还开展了体外培养髓系白血病干细胞(leukemia stem cells,LSC)并鉴定其特征的初步研究。 方法设计含有GM-CSF信号肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位点的引物,PCR扩增TNFa-Tumstatin,将扩增产物亚克隆到带有GFP标记的pAdTrack-CMV穿梭质粒上。重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转化含有腺病毒骨架质粒的BJ5183中同源重组,筛选获得含有融合基因的重组腺病毒质粒,酶切鉴定并测序。同时构建不含目的基因的空重组腺病毒表达载体作为对照。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化,用磷酸钙转染293A细胞,经过包装、扩增后感染人脐带间质干细胞,然后分别用RT-PCR、流式细胞仪、ELISA、MTT法及LDH释放法等方法鉴定融合基因及蛋白的表达,评价TNFa-Tumstatin修饰的hUCMSCs的抗肿瘤活性;体外培养急性髓系白血病患者的骨髓单个核细胞,观察其形态学特征、长期存活及增殖特性,采用染色体分析和流式分析技术研究其核型和细胞表面标志,应用RT-PCR技术分析其nucleostemin、Bmi-1、ABCG2、prominin1、OCT4、Nanog等干细胞相关基因的表达。 结果PCR和酶切分析的结果表明成功地构建了携带有目的基因的重组腺病毒载体,测序结果证实与设计片断的序列一致。PacⅠ线性化后采用磷酸钙方法转染293A细胞,可见GFP表达,裂解细胞,收获病毒,可反复感染293A细胞。将包装好的病毒感染hUCMSCs,24h后可见GFP表达,随着时间延长,GFP表达明显增强,72h感染效率大于90%。RT-PCR结果表明融合基因在细胞中表达,ELISA结果证实细胞表达并分泌融合蛋白。培养上清液能抑制ECV-304细胞的增殖和杀伤白血病细胞U937、THP-1;在另外的研究中,从急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞中,培养出一株长期传代细胞,能够在体外12个月以上存活并保持其增殖特性,呈集落样悬浮生长,染色体核型为亚四倍体,细胞表达CD38、CD29、CD44和HLA-DR,弱表达CD19和CD71,不表达CD34、CD13、CD2和CD105,能够表达nucleostemin、Bmi-1、ABCG2、prominin1、OCT4和Nanog等基因。 结论成功构建了TNFa-Tumstatin融合基因的腺病毒表达载体(AdGFP/TNFa-Tumstatin),高效转染hUCMSCs,TNFa-Tumstatin融合基因修饰的hUCMSCs能表达和分泌融合蛋白,有效地发挥体外抗肿瘤的作用;经长期培养所获得的一株白血病细胞,具备了白血病干细胞的一些特征,为从白血病干细胞水平开展融合基因修饰的hUCMSCs抗白血病研究奠定了实验基础。
[Abstract]:Objective to construct adenovirus expression vector of TNFa-Tumstatin fusion gene containing green fluorescent protein (GFP) and transfect it into human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs), and to study the antitumor effect of hUCMSCs modified by TNFa-Tumstatin gene by secreting TNFa-Tumstatin fusion protein in vitro. A preliminary study was carried out on the in vitro culture of leukemia stem cells from myeloid leukemia cells. Methods TNFa-Tumstatin was amplified by PCR with GM-CSF signal peptide sequence and Bgl 鈪，

本文编号：1822744