自身免疫抗体噬菌体库的构建及初步鉴定

发布时间：2018-05-05 05:03

  本文选题：自身免疫性疾病 + 噬菌体抗体库　； 参考：《第二军医大学》2009年硕士论文

【摘要】： 研究目的: 自身免疫性疾病(autoimmune diseases, AID)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损伤所引起的疾病,是一类较常见的难治病。其突出特点是患者体内产生高滴度自身抗体,并通过免疫复合物等途径,产生针对自身组织的免疫病理性损伤,累及一个或全身多个器官、系统。自身免疫病发病机制十分复杂,涉及因素众多。一般认为以免疫活性细胞数量和功能的失常,导致免疫功能紊乱,从而产生大量自身抗体为主要机制,但具体机制并不明确。因而自身抗体的研究往往成为对自身免疫性疾病研究的关键点和切入点。 目前,自身免疫病的诊断手段非常有限,主要是在结合临床的基础上,依赖实验室检查,在AID患者体内检测到一种或多种高效价的自身抗体为诊断该病的重要依据。自身免疫病缺乏特异的早期诊断指标及特效的治疗药物,这都直接影响了疾病的诊断和治疗。因此,获得纯化的可以满足不同需要的高亲和力、高特异性自身抗体对于研究自身免疫性疾病的发病机制及临床诊疗都具有非常重要的价值。 抗体的制备工艺历经100多年的发展,经历了从多克隆抗体、单克隆抗体到人源化抗体的不同阶段。在人源单克隆抗体的制备技术中,噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体制备技术之一。利用此技术,外源蛋白或多肽的基因与噬菌体外壳蛋白的基因融合,外源产物表达在噬菌体的表面,从而实现了基因型与表现型的完美统一。目前,国内外已成功构建了针对乙肝病毒、肿瘤细胞等多种抗原的噬菌体抗体库,并从中筛选得到具有较高亲和力和特异性的抗体,潜藏着巨大的应用价值。 本课题采用噬菌体抗体库技术,以50多例自身免疫病患者的外周血淋巴细胞为原料,构建出自身免疫性疾病的噬菌体抗体库,并以确定的自身抗原dsDNA作为固相抗原,从抗体库中筛选、富集出相关抗体,以鉴定所构建抗体库的有效性,为进一步利用该抗体库筛选出不同需要的抗体及其功能研究提供平台。 研究方法: 1.从55名自身免疫性疾病患者(包括SLE、RA、强直性脊柱炎、干燥综合征、PBC等)外周血中分离出单个核细胞,抽提总RNA,反转录生成cDNA,以内参GADPH验证混合cDNA的质量; 2.以上述cDNA为模板PCR扩增轻链和重链基因; 3.挑取XL1-Blue的单克隆菌落,采用Hepes法制备感受态细胞; 4.将轻链基因克隆入pComb3Hss载体以构建轻链库; 5.将重链基因载入重组轻链库,构建组合文库H+L+pComb3Hss; 6.将组合文库转化大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体M13KO7,随机的组合文库表达于噬菌体表面,完成噬菌体表面展示; 7.用商品化anti-dsDNA ELISA试剂盒,对噬菌体抗体进行4轮亲和富集,测定抗体库滴度; 8.间接ELISA法鉴定4轮淘选后的噬菌体抗体,提取阳性克隆的的噬菌粒,切除gIII片段,自连接后转化XL1-Blue,以IPTG诱导可溶性Fab片段的表达; 9.分别用anti-dsDNA和anti-U1RNP检测试剂盒对制备好的Fab片段进行ELISA检测,鉴定其抗原特异性。 结果: 1.抽取总RNA 7-10ug,抽提的RNA质量可靠,经GADPH验证的cDNA质量可靠; 2. PCR扩增了大小为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了重组轻链库,菌落计数得轻链库的库容约4×105,酶切鉴定重组率为80%; 3.同法测得噬菌体抗体库的库容为6×106,酶切鉴定重组率为70%,PCR鉴定证明轻重链均已转入,噬菌体抗体库构建成功; 4.用抗原固相法对噬菌体抗体库进行了4轮亲和富集,第1轮洗脱的滴度为1.1×105,第2、3轮都较前有较大提高,第4轮产出率比第1轮加了218倍; 5.通过固相化抗原吸附法筛选获得2个阳性克隆,切除gIII基因,实现了可溶性Fab片段的表达; 6.间接ELISA法检测显示6株Fab片段克隆均呈dsDNA阳性,U1RNP阴性,证实获得的可溶性抗体Fab片段具有特异性抗原结合活性。 结论: 利用自身免疫性疾病患者的外周血单个核细胞制备了混合cDNA,并在此基础上成功构建了自身免疫性疾病的噬菌体抗体库,经亲和富集后实现了抗体Fab段的可溶性表达,并具有较强的抗原特异性,因此该抗体库的建立为进一步筛选出其他高亲和力的自身抗体及其功能研究打下了基础,提供了良好的库源。
[Abstract]:Purpose of study :



autoimmune diseases ( AID ) refers to the diseases caused by autoimmune diseases caused by autoimmune diseases of the organism , and is a common refractory disease . The prominent feature is that a high titer self - antibody is generated in the body of the patient , and a plurality of organs and systems are generated aiming at the autoimmune diseases of the self - tissues through an immune complex and the like .



At present , the diagnosis method of autoimmune diseases is very limited , mainly based on the combination of clinic , relies on laboratory tests , and detects one or more high - potency self - antibodies in AID patients as an important basis for the diagnosis of the disease .



In the preparation technology of human monoclonal antibody , the phage antibody library technology is one of the most mature and most widely used antibody preparation techniques .



The phage antibody library of autoimmune diseases was constructed by using phage antibody library technique . The phage antibody library of autoimmune diseases was constructed . The antibody library was screened and enriched from the antibody library by using the determined self - antigen DNA as the solid phase antigen . The antibody library was screened and enriched to identify the effectiveness of the antibody library .



Study method :



1 . Individual nuclear cells were isolated from peripheral blood of 55 patients with autoimmune diseases ( including SLE , RA , ankylosing spondylitis , dry syndrome , PBC , etc . ) , total RNA was extracted , cDNA was generated by reverse transcription , and the quality of mixed cDNA was verified by internal reference GADPH ;



2 . PCR amplification of light chain and heavy chain genes using the cDNA as a template ;



3 . taking XL1 - Blue monoclonal colony , preparing competent cells by Hepes method ;



4 . cloning a light chain gene into a pComb3Hss vector to construct a light chain library ;



5 . loading the heavy chain gene into a recombinant light chain library to construct a combinatorial library H + L + pComb3Hss ;



6 . transforming the combinatorial library into Escherichia coli XL1 - Blue , adding the auxiliary phage M13KO7 , and the random combination library is expressed on the surface of the phage to finish the surface display of the phage ;



7 . The phage antibody was subjected to four rounds of affinity enrichment and the antibody library titer was determined by commercial anti - dsDNA ELISA kit .



8 . The phage antibodies after 4 rounds of panning were identified by indirect ELISA , the phage antibodies were extracted from positive clones , gIII fragments were excised , XL1 - Blue was transformed after ligation , and the expression of soluble Fab fragments was induced by IPTG .



9 . The prepared Fab fragment was detected by ELISA and the specificity of antigen was identified by ELISA .



Results :



1 . Total RNA was extracted from 7 - 10ug , the quality of extracted RNA was reliable , and the quality of cDNA verified by GADPH was reliable ;



2 . PCR amplified the light chain kappa , lambda gene and heavy chain fd gene whose size was 660bp , and the recombinant light chain library was constructed successfully , the library volume of light chain library was about 4 脳 105 , and the recombination rate was 80 % .



3 . The library capacity of phage antibody library was 6 脳 106 , the recombinant rate was 70 % , and PCR identification demonstrated that the heavy chain was transferred and the phage antibody library was constructed successfully .



4 . 4 rounds of affinity enrichment were carried out on phage antibody library by using antigen solid phase method , the titer of the first round was 1.1 脳 105 , the second and third round were significantly improved , and the fourth round yield was 218 times higher than that of the first round ;



5 . Two positive clones were obtained by solid - phase antigen adsorption , gIII gene was excised , and the expression of soluble Fab fragment was achieved .



6 . Both Fab fragments of 6 Fab fragments were detected by indirect ELISA . The results showed that the Fab fragments of 6 Fab fragments were positive and U1RNPs were negative , and the Fab fragment of soluble antibody was confirmed to have specific antigen binding activity .



Conclusion :



The mixed cDNA was prepared by using mononuclear cells from peripheral blood mononuclear cells of patients with autoimmune diseases . The phage antibody library of autoimmune diseases was successfully constructed . After affinity enrichment , the soluble expression of antibody Fab fragment was realized .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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