猪骨髓间充质干细胞体外向心肌细胞分化的实验研究

发布时间：2018-05-10 22:18

  本文选题：骨髓 + 间充质干细胞　； 参考：《中国协和医科大学》2008年博士论文

【摘要】： 目的:探讨猪骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)自发分化和5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞的潜能,以及体外向心肌细胞分化的规律性。 方法:抽取猪髂骨骨髓,密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁培养法筛选和培养MSCs,选取第9,10,11,12,15和20代MSCs,研究其向心肌样细胞自发分化潜能和5-氮胞苷诱导后4周能否分化为心肌细胞,并探索猪MSCs体外向心肌细胞分化的规律性。各代MSCs采用连续显微镜下观察、流式细胞仪、免疫细胞化学染色法、Real Time-PCR、透射电镜检测相关指标。 结果:体外自然培养条件下,P9,P11,P12,P15,P20和大部分P10 MSCs形态一致,呈梭形成纤维细胞样形态,但部分P10细胞多核、胞浆延长,转变为肌管样形态。5-氮胞苷诱导1周后,部分P9,P11,P12,P15和P20MSCs表现为较长的胞浆形态和多核化,4周后更多细胞相互连接形成不规则的管样结构,而P10MSCs则形成相对规则的肌管样结构。 流式法显示,P10MSCs的G0/G1期比例显著增多(88.00±3.90)%,P10与P9相比有显著性差异(P＜0.0001),出现细胞生长停滞。贴壁细胞CD90、CD29阳性,而CD34、CD45阴性,说明贴壁细胞为MSCs。 免疫细胞化学染色显示,自然培养和诱导4周后各代MSCs均表达心肌特异性结构蛋白Cx43和α-sarcomeric actin,而诱导后P10MSCs分化率与其他各代相比有显著性差异(P=0.011)。 Real time-PCR结果表明,自然培养和诱导4周后的各代MSCs均有心肌特异性转录因子GATA4和结构基因MLC、α-SKA、Cx43、cTNI基因表达,而P10MSCs自然培养和诱导后4周,各基因的表达丰度均高于其他代在相同条件下的分化细胞,而α-SKA诱导后增高显著(P＜0.0001),而P20MSCs表达的基因减少。 透射电镜显示在自然培养状态下和诱导后4周,P9,P10,P11,P12,P15 MSCs均有较多不规则细肌丝,而P10MSCs经诱导后出现较多不规则排列粗肌丝,P20MSCs肌丝减少。 结论:1.猪骨髓MSCs在体外自然培养条件下,各代形态、增殖能力和分化潜能是不均一的,传代次数的增加MSCs增殖逐渐变慢、部分细胞自发分化为心肌样细胞。2.MSCs于第10代出现细胞生长停滞,但并没有丧失多向分化潜能。3,在体外长期培养过程中,MSCs出现转化能力。4.5-氮胞苷可诱导MSCs分化为心肌样细胞,P10MSCs分化更具有成熟心肌细胞的特异性表型。4.结合本实验研究组前期的结果,推测P10可能是猪MSCs体外分化为心肌细胞过程中的拐点。
[Abstract]:Aim: to investigate the spontaneous differentiation of porcine bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) and the potential of 5-azacytidine (5-azacytidine) induced differentiation into cardiomyocytes, and the regularity of differentiation into cardiomyocytes in vitro. Methods: mononuclear cells were isolated from porcine iliac bone marrow by density gradient centrifugation. MSCs were selected and cultured by adherent culture method. The spontaneous differentiation potential of MSCs into cardiomyocyte-like cells and whether 5-azacytidine could differentiate into cardiomyocytes 4 weeks after induction were studied, and the regularity of porcine MSCs differentiation to cardiomyocytes in vitro was explored. All generations of MSCs were observed under a continuous microscope, flow cytometry, immunocytochemical staining, Real Time-PCR, and transmission electron microscopy (TEM) were used to detect the relative indexes. Results: in natural culture in vitro, the morphology of P9, P11, P12, P15, P20 and P10 MSCs was the same as that of most P10 cells, but some P10 cells were polynucleated and the cytoplasm was lengthened, which was transformed into myotube like form. 5-azacytidine was induced for 1 week. Some of P9 P11 P12 P15 and P20MSCs showed long cytoplasmic morphology and more cells connected to each other to form irregular tubular structure after 4 weeks of polynucleation, while P10MSCs formed a relatively regular myotube structure. Flow cytometry showed that the proportion of P10 MSCs in G0/G1 phase was significantly increased (88.00 卤3.90), and there was significant difference between P10 and P9 (P < 0.0001). The adherent cells were positive for CD90 and CD29, but negative for CD34 and CD45, indicating that the adherent cells were MSCs. Immunocytochemical staining showed that MSCs expressed myocardial specific structural protein Cx43 and 伪 -sarcomeric actinin in all generations after 4 weeks of natural culture and induction, but the differentiation rate of P10MSCs was significantly different from that of other generations. Real time-PCR results showed that myocardial specific transcription factor (GATA4) and structural genes (MLC, 伪 -SKAN Cx43 cTNI) were expressed in all generations of MSCs after 4 weeks of natural culture and induction, while P10MSCs was expressed at 4 weeks after natural culture and induction. The expression abundance of each gene was higher than that of other generation differentiation cells under the same condition, but 伪 -SKA increased significantly (P < 0. 0001), while the gene expression of P20MSCs decreased. Transmission electron microscope showed that there were more irregular fine filaments in P9 P10P10P11P12P15 MSCs in natural culture and 4 weeks after induction, but more irregular arrangement of coarse myofilament P20MSCs decreased after P10MSCs induction. Conclusion 1. Under the condition of natural culture of porcine bone marrow MSCs in vitro, the morphology, proliferative ability and differentiation potential of each generation were different, and the increase of passage number of MSCs gradually slowed down the proliferation of MSCs. Some of the cells spontaneously differentiated into cardiomyocyte-like cells. 2. MSCs had cell growth arrest in the 10th generation. However, it did not lose the potential of multidirectional differentiation. During the long-term culture in vitro, the ability of transforming MSCs into cardiomyocyte-like cells could be induced by 4.5-azacytidine, and the differentiation of P10MSCs was more specific phenotypic than that of mature cardiomyocytes. Based on the previous results of this study group, we speculated that P10 might be the inflection point in the process of porcine MSCs differentiation into cardiomyocytes in vitro.
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329

【共引文献】

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本文编号：1871162