伤寒沙门菌PhoP对鞭毛抗原基因fljB：z66的表达调节

发布时间：2018-05-16 17:37

  本文选题：伤寒沙门菌 + phoP基因　； 参考：《江苏大学》2008年硕士论文

【摘要】： 目的:探讨调节因子PhoP对伤寒沙门菌H:z66鞭毛抗原编码基因fljB:z66在各种环境应激下的表达调节作用。 方法: 1.采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌phoP缺陷变异株。根据伤寒沙门菌phoP基因序列,设计PCR特异性引物,并在引物末端加上需要的酶切位点。扩增phoP基因上、下游片段,用BglⅡ消化后,定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段。将此片段胶回收后用后导入自杀质粒pGMB151的BamH I酶切位点,将阳性质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株(GIFU 10007),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。 2.将lacZ基因作为鞭毛抗原基因fljB的报告基因,采用自杀质粒介导的同源重组方法制备fljB∷lacZ变异株,使菌株的β-半乳糖苷酶活性代表fljB基因的蛋白表达水平。通过电击法将含fljB∷lacZ的重组质粒转入野生型及phoP~-伤寒沙门菌,通过在含X-Gal的蔗糖平板上的显色筛选和PCR筛选获得同源重组的fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。 3.对伤寒沙门菌的fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ变异株同时进行高渗应激、氧应激、胆汁应激和弱酸应激,通过比较两者β-半乳糖苷酶活性的变化,研究在不同应激环境下调节因子PhoP是否对鞭毛抗原编码基因fljB:z66存在表达调节作用。 结果: 1.经PCR及序列分析证实变异株中phoP基因缺失了297个碱基,表明成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株。 2.经PCR、X-gal底物显色及序列分析证实,变异株中fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代,表明伤寒沙门菌fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ变异株构建成功,可通过测定其β-半乳糖苷酶活性反映fljB翻译表达水平。 3.对比伤寒沙门菌的fljB∷lacZ和phoP~-fljB∷lacZ变异株在高渗应激、氧应激、胆汁应激和弱酸应激下β-半乳糖苷酶活性变化的差异,结果显示,在低渗环境下,伤寒沙门菌的fljB∷lacZ变异株的β-半乳糖苷酶活性明显高于phoP~-fljB∷lacZ变异株;在高渗应激后,fljB∷lacZ株中β-半乳糖苷酶活性呈从高到低的抑制性变化,而phoP~-fljB∷lacZ株中的酶活性却无明显的动态变化。在氧应激、胆汁应激和弱酸应激时两者β-半乳糖苷酶活性变化无明显差异。 结论:在低渗环境下,伤寒沙门菌调节因子PhoP促进了鞭毛抗原编码基因fljB:z66的表达;在高渗应激下,PhoP可能参与了鞭毛抗原编码基因fljB:z66的表达下调作用。
[Abstract]:Aim: to investigate the regulatory effect of regulatory factor PhoP on the expression of H:z66 flagellum antigen encoding gene fljB:z66 in Salmonella typhimurium under various environmental stresses. Methods: 1. PhoP deficient mutant strains of Salmonella typhimurium were prepared by suicide plasmid mediated homologous recombination. According to the sequence of phoP gene of Salmonella typhimurium, the PCR specific primers were designed, and the necessary endonuclease sites were added to the end of the primers. The upstream and downstream fragments of phoP gene were amplified and digested with Bgl 鈪，

本文编号：1897789