应用水痘—带状疱疹病毒报告细胞系定量带细胞病毒的研究

发布时间：2018-05-20 03:00

  本文选题：水痘-带状疱疹病毒 + 报告细胞系　； 参考：《福建医科大学》2010年硕士论文

【摘要】： 【目的】 构建水痘-带状疱疹病毒(VZV)ORF62表达质粒,并应用VZV报告细胞系MV9G定量带细胞病毒(CAV),以建立筛选抗VZV药物并研究其作用机制的新方法。 【方法】 1、以VZV疫苗株BKvOka基因组DNA为模板、PCR扩增获得ORF62全序列后克隆到高效表达质粒pCAGGS中构建BKvOka ORF62表达质粒pCAG-BKvOka62,再应用双酶切和DNA测序法鉴定所构建质粒的正确性。 2、将倍比稀释的BKvOka株感染MeWo细胞(含BKvOka株CAV)与MV9G细胞共培养72h后,分别用化学发光法检测BKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的萤火虫荧光素酶(RLU)、用间接免疫酶法染色并计数病毒蚀斑(focus numbers)、用SYBR Green荧光定量PCR法检测病毒DNA拷贝数(DNA copies),分别计算RLU/病毒蚀斑数和RLU/病毒DNA拷贝数的比值,分析其相关性,并建立RLU-病毒蚀斑数、RLU-病毒DNA拷贝数和病毒DNA拷贝数-病毒蚀斑数的标准曲线。在培养基中加入阿昔洛韦(ACV)以抑制病毒生长,再以相同方法建立ACV作用下RLU-病毒蚀斑数、RLU-病毒DNA拷贝数和病毒DNA拷贝数-病毒蚀斑数的标准曲线。 3、将随机稀释的GSKvOka株感染MeWo细胞(含GSKvOka株CAV)与MV9G细胞共培养72h后,仍用上述方法检测GSKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的萤火虫荧光素酶(RLU)、病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数。再以MV9G细胞荧光素酶RLU为基数,根据绘制标准曲线时所得RLU/病毒蚀斑数和RLU/病毒DNA拷贝数比值推算GSKvOka株蚀斑数和DNA拷贝数,获得病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数预测值,并将预测值与其实测值比较,以验证应用MV9G细胞定量CAV的可行性。 【结果】 1、通过将BKvOka株ORF62全序列克隆到pCAGGS表达质粒构建了VZV ORF62重组表达质粒pCAG-BKvOka62。经双酶切反应和DNA测序鉴定,克隆的ORF62片段与预期一致,VZV ORF62表达质粒pCAG-BKvOka62得以成功构建。 2、将倍比稀释的BKvOka株CAV与MV9G细胞共培养72h后,BKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.999, P 0.01)、与病毒DNA拷贝数显著相关(r = 0.974, P 0.01),病毒DNA拷贝数与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.979, P 0.01),RLU/病毒蚀斑数=181.62,RLU/病毒DNA拷贝数=1.97×10-4。加入抗病毒药物ACV后RLU与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.991, P 0.01)、与病毒DNA拷贝数显著相关(r =0.971, P 0.01),病毒DNA拷贝数与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.936, P 0.05)。 3、将随机稀释的GSKvOka株CAV与MV9G细胞共培养72h后,GSKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.992, P 0.01)、与病毒DNA拷贝数显著相关(r = 0.988, P 0.01),病毒DNA拷贝数与病毒蚀斑数显著相关(r = 0.966, P 0.01)。根据GSKvOka株CAV激发MV9G细胞荧光素酶RLU值推算的病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数预测值与其实测值基本一致。 【结论】 1、成功构建BKvOka株ORF62表达质粒pCAG-BKvOka62,为荧光定量PCR法检测VZV DNA提供了质粒模板标准品,为进一步应用VZV报告细胞系定量CAV奠定了基础。 2、以已知量BKvOka株CAV与MV9G细胞共培养时,无论是否加入抗病毒药物ACV,BKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的萤火虫荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数均显著相关。以未知量GSKvOka株CAV与MV9G细胞共培养时CAV激发MV9G细胞表达的荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数仍显著相关。根据RLU推算出的病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数的预测值与其实测值基本一致。提示MV9G细胞与CAV共培养时受CAV激发表达荧光素酶RLU的变化可以反映病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数的变化。因此,应用MV9G细胞定量CAV是可行的。 3、应用VZV报告细胞MV9G定量CAV克服了免疫酶染色法和荧光定量PCR法过程烦琐、难客观、易污染等缺点,具有简便、快速、敏感、客观和高通量的特点,为进一步建立抗VZV药物筛选和作用机制研究方法奠定了基础。
[Abstract]:[Objective]
To construct the ORF62 expression plasmid of varicella zoster virus (VZV) and use VZV to report the cell line MV9G quantitative band virus (CAV), in order to establish a new method for screening anti VZV drugs and to study the mechanism of its action.
[method]
1, the BKvOka genome DNA of the VZV vaccine strain was used as a template. The full sequence of ORF62 was amplified by PCR and then cloned into the high expression plasmid pCAGGS to construct BKvOka ORF62 expression plasmid pCAG-BKvOka62. Then the correctness of the constructed plasmid was identified by double enzyme cutting and DNA sequencing.
2, after co culture of MeWo cells (including BKvOka strain CAV) and MV9G cells and co culture 72h, the fluorescent method was used to detect the luciferase luciferase (RLU) expressed by BKvOka strain CAV, and the virus plaque (focus numbers) was stained and counted by indirect immunization enzyme method. DNA copies, calculated the ratio of the number of RLU/ virus plaque and the DNA copy number of the RLU/ virus, analyzed its correlation, and established the standard curve of the number of RLU- virus plaque, the DNA copy number of the RLU- virus and the number of virus DNA copies - virus plaque. The standard curve of RLU- virus spot number, RLU- virus DNA copy number and virus DNA copy number virus plaque number were used.
3, after the random diluted GSKvOka strain (including GSKvOka strain CAV) and MV9G cells were co cultured with MV9G cells, the fluorescein luciferase (RLU), the number of virus plaque and the DNA copies of the virus, and the number of virus plaque and the DNA copies of the virus were still detected by the above method. The number of virus plaque and the DNA copy number of RLU/ virus calculated the number of GSKvOka plaque and DNA copy number, obtained the number of virus plaque and the predictive value of the DNA copy number of the virus, and compared the predicted value with the actual test value, in order to verify the feasibility of applying the quantitative CAV of MV9G cells.
[results]
1, the recombinant expression plasmid pCAG-BKvOka62. of VZV ORF62 was constructed by cloning the whole sequence of BKvOka strain ORF62 into pCAGGS expression plasmid and identified by the double enzyme digestion reaction and DNA sequencing. The ORF62 fragment of the clone was consistent with the expectation, and the VZV ORF62 expression plasmid was successfully constructed.
2, after co culture of the diluted BKvOka strain CAV and MV9G cells for 72h, the luciferase (RLU) expressed by the BKvOka strain of MV9G cells was significantly correlated with the number of virus plaque (r = 0.999, P 0.01), which was correlated with the DNA copy number of the virus (r = 0.974, 0.01), and the number of virus copying shells was significantly correlated with the number of virus plaque (0.979, 0.01). The number of plaque was =181.62, and the number of RLU/ virus DNA copies =1.97 x 10-4. was significantly correlated with the number of virus plaque (r = 0.991, P 0.01) after ACV was added to the antiviral drug (r = 0.991, P 0.01), which was significantly correlated with the number of DNA copies of the virus (R =0.971, 0.01).
3, after the random dilution of GSKvOka strain CAV and MV9G cells was co cultured for 72h, the luciferase (RLU) expressed by GSKvOka strain MV9G cells was significantly correlated with the number of virus plaque (r = 0.992, P 0.01), which was significantly correlated with the number of viral DNA copies (r = 0.988, 0.01), and the number of copies of the virus was significantly correlated with the number of virus plaque (0.966, 0.01). The predicted number of virus spots and the number of viral DNA copies predicted by KvOka RLU CAV stimulated MV9G cells were basically consistent with the measured values.
[Conclusion]
1, the ORF62 expression plasmid pCAG-BKvOka62 of BKvOka strain was successfully constructed, which provided the standard plasmid template for the detection of VZV DNA by fluorescence quantitative PCR method, which laid the foundation for the further application of VZV to report the quantitative CAV of the cell line.
2, when the known amount of BKvOka strain CAV and MV9G cells were co cultured, whether or not ACV was added to the antiviral drug, the fluorescent firefly luciferase (RLU) expressed by BKvOka strain CAV was significantly correlated with the number of virus plaque and the number of viral DNA copies. LU) is still closely related to the number of virus plaque and the number of DNA copies of the virus. The predictive value of the number of virus plaque and the number of copies of the virus DNA calculated according to RLU is basically the same as that of the actual test. It is suggested that the changes in the CAV stimulated expression of luciferase RLU in co culture of MV9G cells and CAV can reflect the changes in the number of virus plaque and the number of DNA copies of the virus. Therefore, the change of the number of virus plaque and the number of virus DNA copies should be reflected. Therefore, the change of the number of virus plaque and the number of virus DNA copies should be reflected. Therefore, the change of the number of virus plaque and the number of virus DNA copies should be reflected. It is feasible to use MV9G cells to quantify CAV.
3, the application of VZV report cell MV9G quantitative CAV overcomes the shortcomings of the immune enzyme staining and fluorescence quantitative PCR process, which is easy, rapid, sensitive, objective and high throughput. It lays a foundation for the further establishment of anti VZV drug screening and mechanism research methods.
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R373

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 ;英科学家首次测出活体心脏能量水平[J];生命世界;2006年11期

2 罗薇;张金灵;夏梦芸;刘内生;裴超信;;Ⅰ型鸭肝炎病毒(MY株)活疫苗毒种的纯粹及生产条件探索[J];西南民族大学学报(自然科学版);2011年04期

3 唐丽霞;;发光的“魔树”[J];青苹果;2009年10期

4 马月萍;戴思兰;马艳蓉;;荧光定量PCR技术在植物研究中的应用[J];生物技术通报;2011年07期

5 高国生;翁彭剑;纪y=斌;李德周;李永燕;李红山;丁世雄;;靶向HBx小干扰RNA表达载体构建及其功能探讨[J];中国卫生检验杂志;2011年07期

6 朱超;Stefan Ratering;曲东;Sylvia Schnell;;短期淹水培养对水稻土中地杆菌和厌氧粘细菌丰度的影响[J];生态学报;2011年15期

7 朱志文;;巴西雨林重现失落荧光蘑菇[J];科学大观园;2011年16期

8 丁存宝;刘海燕;李桂秋;吴尚卓;贾长虹;;HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂细胞筛选模型[J];生命的化学;2011年04期

9 ;科技要闻[J];科技导报;2011年21期

10 刘静;张国君;;光学分子影像技术及其在药物研发领域的应用[J];生物物理学报;2011年08期

相关会议论文 前10条

1 张建军;施碧红;施巧琴;吴松刚;;高产α-淀粉酶的米曲霉工程菌株的构建[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年

2 王平;吕玉民;刘玉龙;韩林;陈晓培;赵阳辉;;电离辐射致人外周血有核细胞mtDNA 4977bp缺失的实时定量PCR分析[A];中国毒理学会放射毒理专业委员会第七次、中国毒理学会免疫毒理专业委员会第五次、中国环境诱变剂学会致突专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致畸专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致癌专业委员会第二次全国学术会议论文汇编[C];2008年

3 郑敏巧;刘池波;;血清乙肝病毒外膜大蛋白与HBV-M及HBV-DNA检测的关系[A];2008年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2008年

4 王栋;张元女;王明月;夏继光;程立新;李朋飞;李宾;王晨光;郭政;;基于拷贝数数据揭示基因在癌基因组中广泛扩增[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年

5 应康;;cDNA芯片在急性白血病中研究基因表达谱和拷贝数变化的应用[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

6 许丰雯;徐丹;王明晓;陈启民;耿运琪;乔文涛;;以荧光素酶为报告基因定量检测原型泡沫病毒的指示细胞系的建立[A];2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2010年

7 季涛云;吴晔;王静敏;肖静;冷雪荣;李洁;赵海娟;杨艳玲;秦炯;吴希如;姜玉武;;不明原因脑发育迟缓/智力障碍患儿染色体亚端粒区拷贝数异常的研究[A];遗传学与社会可持续发展——2010中国青年遗传学家论坛论文摘要汇编[C];2010年

8 徐强;张学军;杨森;;拷贝数变异(CNVs)的研究进展[A];中华医学会第14次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2008年

9 苏宗权;陈万金;林晓贞;吴志英;王柠;林珉婷;慕容慎行;;肌萎缩侧索硬化症SMN基因定量研究[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年

10 李风云;余军平;张治平;崔宗强;王殿冰;危宏平;张先恩;;溶液增强Gaussia荧光素酶的BRET传感器检测蛋白酶[A];中国化学会第28届学术年会第4分会场摘要集[C];2012年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 夏欣;首信欲在全国拷贝数字北京[N];中国经营报;2002年

2 本报记者 丁一岚;强势国片前后堵截“哈利波特”[N];中国电影报;2007年

3 本报记者 丁一岚;进口影片规避国产大片[N];中国电影报;2007年

4 本报记者 胡嵘;《好奇害死猫》拷贝增至180多个[N];中国电影报;2006年

5 本报记者 关雯;《碟中谍3》：阻击“超人”“挑热暑期票房战”[N];中国电影报;2006年

6 施晨露;超级大片盘踞暑期电影市场[N];解放日报;2008年

7 李妍 丁一岚 关风 李丁;六部影片春节档总动员[N];中国电影报;2006年

8 记者 李妍;《花花型警》300拷贝主打本周市场[N];中国电影报;2008年

9 本报记者 丁一岚;4部影片掘金“十一” 鹿死谁手？[N];中国电影报;2005年

10 本报记者 丁一岚;《佐罗传奇》新鲜登场 《怪物》惊悚搏市[N];中国电影报;2005年

相关博士学位论文 前10条

1 高博;荧光素酶标记的HCV细胞模型的建立及其在药物评价等方面的应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

2 姜轶群;利用海肾荧光素酶双分子互补技术研究Hsp90/Cdc37相互作用[D];吉林大学;2010年

3 张彤雯;APOBEC3B基因拷贝数变异与乙肝相关性肝细胞癌易感性[D];北京协和医学院;2012年

4 张静;神经元限制性沉默因子对CART基因转录的调控作用及其机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

5 杨晓杰;转基因棉花中T-DNA整合特征研究[D];中国农业科学院;2010年

6 涂静;渗透压对人气道上皮细胞黏蛋白5AC分泌的调控研究[D];重庆医科大学;2011年

7 李维娜;乙型肝炎病毒编码蛋白对宿主炎性基因的调控作用及其机制研究[D];华中科技大学;2011年

8 高永辉;PARD3基因单核苷酸多态性和拷贝数变异与神经管畸形发生的相关性研究[D];北京协和医学院;2012年

9 黄灿;综合征型先天性心脏病与拷贝数变异遗传学研究[D];中南大学;2012年

10 杨铁林;利用人类全基因组拷贝数变异和SNP多态性揭示骨质疏松和肥胖症的遗传致病机理[D];西安交通大学;2009年

相关硕士学位论文 前10条

1 卢珍玲;应用水痘—带状疱疹病毒报告细胞系定量带细胞病毒的研究[D];福建医科大学;2010年

2 吴顺泉;多个microRNAs通过直接作用于p21的3'UTR调控p21基因的表达[D];福建医科大学;2010年

3 王礼翠;HCV丝氨酸蛋白酶活性监测体系的建立[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年

4 翟春媛;猪TLR4基因的突变与功能分析[D];东北农业大学;2010年

5 刘成柏;用生物发光免疫技术检测肝肿瘤标志物AFP在肝癌早期诊断中的研究[D];吉林大学;2005年

6 薛丽英;SV40增强子修饰的hTERT核心启动子靶向转录荧光素酶载体的构建和鉴定[D];天津医科大学;2005年

7 黄丽玲;水稻抗病相关基因OsDR2的分离克隆和功能鉴定[D];华中农业大学;2003年

8 唐建华;降脂药物筛选模型的建立及其在决明子降脂作用机理研究中的应用[D];四川大学;2005年

9 刘凤鸣;人PDCD4启动子的确定及其转录调控的初步研究[D];山东大学;2010年

10 刘艳杰;重组萤火虫荧光素酶及其稳定性研究[D];天津大学;2010年

，

本文编号：1912877