Pellino1对心肌肥大调控作用的研究

发布时间：2018-05-27 01:05

本文选题：Pellinol + NF-κB　；参考：《南京医科大学》2010年硕士论文

【摘要】：病理性心肌肥大是导致心力衰竭和突然死亡的主要危险因素。引起心肌肥大的常见因素包括高血压心肌梗死瓣膜病和心肌病等。各种致心肌肥大因素通过心脏细胞内信号转导途径改变相关核转录因子的活性,导致心脏组织中大量基因/蛋白质的表达出现异常,使得心脏的形态结构和功能发生变化。在我们前期的研究中,已证实Toll样受体/白介素-1受体(Toll-like receptor/ Interleukin-1 receptor, TLR/IL-1R)介导的核因子-kB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路在心肌肥大的发生发展中发挥重要的调控作用,但对其具体的细胞内信号转导机制还知之甚少。最近,有研究发现,Pellino蛋白家族对TLR/IL-1R介导的细胞内信号转导起着重要的调控作用。Pellino蛋白家族在哺乳类动物已鉴定出3种亚型,分别称为Pellino1、Pellino2和Pellino3。Pellino蛋白的羧基末端含有一个C3HC4指环样结构基序,该结构主要介导蛋白质-蛋白质以及蛋白质-DNA间直接的作用,其最主要的是具有E3泛素化连接酶的作用。在Pellino蛋白氨基末端包括一个隐藏的FHA (forkhead-associated)结构域,FHA结构域是具有特征性的磷酸苏氨酸结合基序,介导Pellino与TLR/IL-1R信号通路下游重要的信号分子磷酸化白介素-1受体相关激酶-1(IL-1R-associated kinase1, IRAK1)的结合。体外研究发现,Pellino1由IRAK1磷酸化激活,与多种E2复合物如Ubc13 Uev1a、UbcH3、UbcH4、UbcH5a和UbcH5b等结合形成聚泛素化链,发挥E3泛素化连接酶的活性,并且能够被IRAK4磷酸化而增强其E3泛素化连接酶的活性。目前认为Pellino蛋白作为一种E3泛素化连接酶,对TLR/IL-1R信号通路中关键的细胞内信号分子IRAK1、肿瘤坏死因子α受体相关因子6(TNF-αreceptor association factor 6, TRAF6)、TGF-β活化激酶1(TGF-βactivated kinase 1,TAK1)等的激活有重要的调控作用。体外研究已提示,Pellino1可以通过与IRAK1、IRAK4和TRAF6等信号分子相互作用发挥其对IL-1R介导的NF-κB信号转导的调控作用。但Pellino蛋白家族在心肌肥大中的表达变化及其可能的调控作用至今尚不清楚。为此,本研究拟着重探讨Pellino蛋白家族在心肌肥大中的调控作用。本研究包括动物整体实验和和体外细胞实验两部分。在体实验以C57BL/6小鼠主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction, TAC) 4周的方式复制心肌肥厚模型,观察心肌肥大程度,同时,采用RT-PCR和western blot检测Pellino的表达水平,免疫共沉淀实验观察肥大心肌组织中Pellino1与IRAK1的结合情况,EMSA检测NF-κB的DNA结合活性。体外实验以原代培养的乳大鼠心肌细胞为研究对象,以IL-1β为刺激物诱导心肌细胞肥大,采用shRNA干扰Pellino1的表达,探讨Pellino1在心肌细胞肥大形成中的作用,同时通过免疫共沉淀方法观察其对TRAF6泛素化水平的影响,并观察NF-κB结合活性的改变。在体实验结果显示小鼠TAC 4周可导致明显的心肌肥大,TAC组小鼠心重/体重比值(heart weight-to-body weight ratio, HW/BW)和左心室/胫骨长度比值(left ventricular weight to tibial length ratio, LVW/TL)与假手术组相比分别上升了20.89% (4.700±0.05514 Vs 5.682±0.1336,P0.001, n=6)和16.11% (4.898±0.05935 Vs 5.687±0.1319, P0.001, n=6)。左心室心肌组织HE染色及Masson染色显示,TAC组心肌细胞横切面积明显增加,细胞间隙中纤维结缔组织增多。RT-PCR结果显示在肥大的心肌组织中Pellino1的mRNA表达水平与假手术组相比增高了194.96% (0.1825±0.0213 Vs 0.5383±0.09187, P0.01, n=6),Pellino3的mRNA表达水平与假手术组相比降低了46.55%(0.3562±0.05083 Vs 0.1904±0.02016, P0.05, n=6)。TAC组与假手术组左心室肌组织中Pellino2的mRNA表达水平没有明显变化。我们选取Pellino1作为进一步的研究目标。Western blot结果显示,在肥大的心肌组织中Pellino1蛋白表达水平比假手术组增高了74.85% (0.4092±0.03334 Vs 0.7155±0.03945, P0.01, n=5)。免疫共沉淀结果显示肥大心肌组织中IRAK1与Pellino1的结合水平比假手术组增高了48.93% (0.2624±0.03442 Vs 0.3908±0.040205, P0.05, n=5)。EMSA结果显示肥大心肌组织中NF-κB的DNA结合水平与假手术组相比增高了128.76% (5508±343.8 Vs 12600±629.8, P0.001, n=5)。上述研究结果表明,在TAC诱导的心肌肥大发展过程中Pellino1表达水平明显增加、Pellino1与IRAK1的交互作用增强、该信号通路下游的核转录因子NF-κB活性增加,提示在压力超负荷诱导的心肌肥厚模型中,Pellino1与IRAK1/NF-κB信号通路的激活,以及心肌肥大的发生发展具有相关性。为了明确Pellino1是否通过调控IL-1R介导的NF-κB信号通路在心肌细胞肥大过程中发挥重要作用,我们进一步采用IL-1β作为刺激物,探讨Pellino1在体外培养的原代乳大鼠心肌细胞肥大形成中的作用。结果发现,用10ng/ml的IL-1β刺激36小时能明显诱导心肌细胞肥大,其细胞面积比空白对照组升高41.69% (4749±276.3 Vs 6729±327.5, P0.001, n=3), IL-1β组Pellino1 mRNA的表达水平与对照组相比升高了182.6% (0.1121±0.01471 Vs 0.3168±0.03206, P0.01, n=3)。转染shPellino1抑制Pellino1的表达之后,能明显减少IL-1β诱导的心肌细胞肥大,其细胞面积比IL-1β刺激组减少了47.41% (6729±327.5 Vs 3539±189.8, P0.001, n=3)。我们还观察到转染shPellino1组与空白对照组相比,其细胞面积也减少了25.48% (4749±276.3 Vs 3539±189.8, P0.05, n=3)。IL-1β能明显诱导心肌细胞蛋白合成的增加,其3H-亮氨酸掺入量比空白对照组升高23.64% (7714±275.0 Vs 9538±386.8, P0.01, n=3)。转染shPellino1能明显抑制IL-1β诱导的心肌细胞蛋白合成的增加,其3H-亮氨酸掺入量比IL-1β组降低68.89% (9538±386.8 Vs 2967±148.2, P0.001, n=3)。我们还观察到转染shPellino1组与空白对照组相比,其3H-亮氨酸掺入量减少了61.54% (7714±275.0 Vs 2967±148.2, P0.001, n=3)。IL-1β刺激使心肌肥大特异性指标心房利钠肽(atrial natriuretic peptide, ANP) mRNA水平明显升高,比空白对照组升高238.10% (0.2614±0.03181 Vs 0.8838±0.04803,P0.001, n=3);转染shPellino1后再给予IL-1β刺激,ANP mRNA水平比IL-1β刺激组减少80.76% (0.8838±0.04803 Vs 0.1700±0.06283, P0.001, n=3)。IL-1β刺激使心肌肥大特异性指标脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP) mRNA水平明显升高,比空白对照组升高232.4% (0.4179±0.01199 Vs 0.6363±0.02676, P0.001, n=3);转染shPellino1之后再给予IL-1β刺激, BNP的mRNA水平比IL-1β刺激组减少42.57% (0.6363±0.02676 Vs 0.2297±0.2297, P0.001, n=3)。给予IL-1β刺激36小时后,心肌细胞NF-κB结合活性增加了59.26% (8330±404.7 Vs 13266±434.5, P0.05, n=3),转染shPellino1后再给予IL-1β刺激,可使IL-1β引起的NF-κB结合活性降低49.13% (13266±434.5 Vs 6749±1012, P0.01, n=3)。转染shPellino1也使IL-1β诱导的TRAF6的泛素化水平降低(尚需进一步重复)。体外实验结果显示,Pellino1在IL-1β刺激的心肌细胞中表达是上调的,抑制Pellino1的表达可明显减轻IL-1β诱导的心肌肥大反应,同时抑制NF-κB的结合活性,表明Pellino1在IL-1β诱导的心肌细胞肥大反应中起着至关重要的作用,其机制可能与其调控IL-1R介导的NF-κB激活相关。综合在体及体外两部分实验结果提示,Pellino1是心肌肥大过程中一个重要的调节蛋白,Pellino1可能通过与IRAK-1相互结合参与NF-κB信号通路的调控,从而在压力负荷诱导的心肌肥大以及IL-1β诱导的心肌肥大反应中发挥重要的调控作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

【参考文献】