重组乙酰胆碱受体α亚单位-BirA识别多肽序列基因的构建与表达

发布时间：2018-07-16 19:00

【摘要】： 目的:构建重组乙酰胆碱受体α亚单位-BirA识别多肽序列基因(pcDNA3.1-AChRα-BirA)并对其进行真核基因表达。方法:设计引物生物素蛋白连接酶(BirA)识别多肽序列基因。将载体pcDNA3.1-AChRα经限制性核酸内切酶EcoRv单酶切后,用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收并纯化,与BirA识别多肽序列基因连接。将连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5α并扩增,再用EcoRv单酶切检查BirA识别多肽序列基因插入的正确性,并测序验证,然后将构建成功的载体在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达。表达产物以绿色荧光标记,经激光扫描共聚焦显微镜验证。结果:电泳检查发现了大小为63 bp的条带,并测序验证了插入的基因序列为BirA识别多肽序列基因。转染后,经激光扫描共聚焦显微镜可观察到CHO细胞膜上的绿色荧光。结论:成功构建了AChRα-BirA识别多肽序列基因重组载体,并在CHO细胞中很好表达。本实验为下一步构建AChRα四聚体并作为抗原检测乙酰胆碱受体抗体奠定了基础。
[Abstract]:Aim: to construct recombinant acetylcholine receptor 伪 subunit -BirA recognition polypeptide gene (pcDNA3.1-AChR 伪 -BirA) and express it in eukaryotic. Methods: primer biotin protein ligase (BirA) was designed to recognize polypeptide gene. The vector pcDNA3.1-AChR 伪 was digested by restriction endonuclease EcoRv and purified by low melting point agarose gel electrophoresis. The ligation product was transformed into E. coli DH5 伪 and amplified. The correctness of the insertion of BirA recognized polypeptide gene was examined by EcoRv digestion, and then the constructed vector was expressed in Chinese hamster ovarian cells (Cho). The expressed product was labeled with green fluorescence and verified by laser scanning confocal microscope. Results: a 63 BP fragment was identified by electrophoresis, and the inserted gene was confirmed by sequencing as a BirA recognized polypeptide gene. Green fluorescence on Cho cell membrane was observed by laser scanning confocal microscope after transfection. Conclusion: AChR 伪 -BirA recognition polypeptide gene recombinant vector was successfully constructed and expressed well in Cho cells. This study laid a foundation for the further construction of AChR 伪 tetramer and the detection of acetylcholine receptor antibodies as antigens.
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：2127361