结核分枝杆菌Rv3627c基因的克隆表达与功能分析

发布时间：2018-07-29 14:26

【摘要】： 结核分枝杆菌的细胞壁是维持其生长和增殖的重要结构,主要由分枝菌酸、阿拉伯聚糖半乳聚糖和肽聚糖(mycolic acid-arabinogalactan- petidoglycan,mAGP)三部分组成,其中肽聚糖是细菌生长所必需的。青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins, PBPs)参与肽聚糖的合成和维护,因此,鉴定结核分枝杆菌中的青霉素结合蛋白,有助于了解肽聚糖的代谢机理。 我们通过生物信息学的方法和细菌之间的相似性预测结核分枝杆菌基因组中的Rv3627c基因的表达产物为可能的PBPs,其结构两次跨膜,并且可能具有羧肽酶或内肽酶的活性,参与肽聚糖的重建和多肽链之间的交联,有可能成为新的潜在的抗结核药物作用靶点。为了分析结核分枝杆菌中基因Rv3627c的功能,我们设计此课题进行研究:首先克隆结核分枝杆菌的Rv3627c基因,然后分别在大肠杆菌BL21(DE3)、C41(DE3)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Sm)中表达重组蛋白,并设计酶促反应分析该蛋白质的功能。 目的:(1)通过PCR的方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA中扩增出Rv3627c基因; (2)分别构建pET29b-Rv3627c和pVV16-Rv3627c表达载体;(3)分别在大肠杆菌BL21(DE3)、C41(DE3)和耻垢分枝杆菌mc2155中表达Rv3627c蛋白;(4)分析Rv3627c蛋白是否具有羧肽酶活性。 结果: 1. Rv3627c基因的克隆 从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库(http://genolist.pasteur. fr/TubercuList/)中获得Rv3627c基因的核苷酸序列(1395 bp)。根据其核苷酸序列设计上下游PCR引物,并分别在其上游引物和下游引物的5’端引入了NdeI和XhoI限制性酶切位点。以H37Rv菌株基因组DNA为模板扩增出了Rv3627c基因。 将Rv3627c基因克隆到pMD18载体,并对Rv3627c进行DNA序列测定。结果显示所克隆的Rv3627c基因与H37Rv菌株基因组数据库中Rv3627c基因的核苷酸序列完全一致,说明在本次实验中通过PCR的方法获得的Rv3627c基因为正确扩增的基因,无碱基突变。 2. pET29b-Rv3627c的构建及Rv3627c蛋白在大肠杆菌中的表达 用NdeI和XhoI双酶切pMD-Rv3627c,将Rv3627c基因克隆到表达载体pET29b。在pET29b-Rv3627c中,Rv3627c蛋白的C端与质粒上的组氨酸标签形成融合蛋白。 用pET29b-Rv3627c质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3) ,并加入IPTG诱导表达重组蛋白。用SDS-PAGE鉴定了诱导表达的Rv3627c蛋白。 用pET29b-Rv3627c质粒转化到大肠杆菌C41(DE3)的感受态细胞,用0.1 mM IPTG在37℃诱导C41(DE3)/pET29b-Rv3627c细菌3小时。超声破碎细菌后对上清和沉淀组分进行SDS-PAGE分析,结果表明Rv3627c蛋白在大肠杆菌C41(DE3)中被诱导表达。通过组氨酸-Ni2+亲和层析技术纯化Rv3627c蛋白,对纯化的Rv3627c蛋白进行定量(考马斯亮蓝法),第1洗脱组分中Rv3627c蛋白浓度为1.03 mg/ml,并通过SDS-PAGE鉴定纯化的Rv3627c蛋白。 3. pVV16-Rv3627c表达载体的构建及Rv3627c蛋白在耻垢分枝杆菌mc2155中的表达 用NdeI和HindIII双酶切pMD-Rv3627c,将Rv3627c基因克隆到表达载体pVV16。用pVV16-Rv3627c表达载体电转化mc2155感受态细胞。挑选6个单菌落接种到5 ml含Ka(n25mg/ml)和Tween8(0终浓度0.05%)的LB液体培养基中,在37°C振荡培养72小时,然后大体积培养mc2155p/VV16-Rv3627c细菌。收集、超声破碎细菌,对上清和沉淀组分进行了SDS-PAGE分析,但无预期的蛋白条带。 4. Rv3627c蛋白的酶活性分析 提取mc2155p/VV16-Rv3627c及野生型mc2155细胞壁中的胞壁肽作为底物,设计了酶促反应。利用纸层析方法检测反应生成的产物。通过结果推断结核分枝杆菌Rv3627c基因表达的蛋白质可能具有羧肽酶活性。 结论:在本次研究中,我们分别构建了pET29b-Rv3627c和pVV16-Rv3627c表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)和C41(DE3)表达了Rv3627c蛋白,然后对Rv3627c蛋白进行了鉴定和功能分析,推测其可能具有羧肽酶活性。这一研究结果为我们深入研究结核分枝杆菌细胞壁的代谢机理奠定了基础。
[Abstract]:The cell wall of Mycobacterium tuberculosis is an important structure to maintain its growth and proliferation, mainly composed of three parts, Mycobacterium acid, Arabia galactan and peptidoglycan (mycolic acid-arabinogalactan- petidoglycan, mAGP). Peptidoglycan is essential for the growth of bacteria. Penicillin binding protein (penicillin binding proteins, PBPs). Therefore, identification of penicillin binding proteins in Mycobacterium tuberculosis is helpful to understand the mechanism of peptidoglycan metabolism.
We predict that the Rv3627c gene expression product in the Mycobacterium tuberculosis genome is a possible PBPs by bioinformatics and the similarity between bacteria. It has two transmembrane structures and may have the activity of carboxypeptidase or endopeptidase. It may be a potential new potential to participate in the reconstruction of peptidoglycan and the cross-linking between polypeptide chains. In order to analyze the function of the gene Rv3627c in Mycobacterium tuberculosis, we designed this topic to study: first, we clone the Rv3627c gene of Mycobacterium tuberculosis and then express the recombinant protein in Escherichia coli BL21 (DE3), C41 (DE3) and Mycobacterium fouling (Mycobacterium smegmatis, Sm) and design the enzyme. The function of the protein was analyzed by reaction.
Objective: (1) the Rv3627c gene was amplified from genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis H37Rv by PCR method; (2) construct pET29b-Rv3627c and pVV16-Rv3627c expression vectors respectively; (3) express Rv3627c protein in Escherichia coli BL21 (DE3), C41 (DE3) and Mycobacterium fouling bacilli, and (4) to analyze whether the protein has carboxypeptidase activity. Sex.
Result:
Cloning of 1. Rv3627c gene
The nucleotide sequence of the Rv3627c gene (1395 BP) was obtained from the genomic database of Mycobacterium tuberculosis H37Rv (http://genolist.pasteur. fr/TubercuList/). The upstream and downstream PCR primers were designed according to its nucleotide sequence, and the restriction sites of NdeI and XhoI were introduced into the upstream and 5 'ends of the downstream primers respectively. The genomic DNA amplified the Rv3627c gene from the template.
The Rv3627c gene was cloned to the pMD18 vector and the DNA sequence of Rv3627c was measured. The results showed that the cloned Rv3627c gene was identical to the nucleotide sequence of the Rv3627c gene in the genome database of the H37Rv strain, indicating that the Rv3627c base obtained by PCR's method in this experiment has no base mutation because of the correct amplification of the gene.
Construction of 2. pET29b-Rv3627c and expression of Rv3627c protein in E. coli
The Rv3627c gene was cloned into the expression vector pET29b. in pET29b-Rv3627c with the NdeI and XhoI double enzymes, and the C end of the Rv3627c protein and the histidine tag on the plasmid formed the fusion protein.
The pET29b-Rv3627c plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), and IPTG was used to induce the expression of recombinant protein. The induced expression of Rv3627c protein was identified by SDS-PAGE.
PET29b-Rv3627c plasmids were used to transform the receptive cells of Escherichia coli C41 (DE3), and C41 (DE3) /pET29b-Rv3627c bacteria were induced by 0.1 mM IPTG at 37. After ultrasonic breakage bacteria, the SDS-PAGE analysis of the supernatant and precipitation components was carried out. The results showed that the Rv3627c protein was induced in the C41 (DE3) of Escherichia coli. The purified Rv3627c protein was purified by technique, and the purified Rv3627c protein was quantified (Kaumas brilliant blue). The concentration of Rv3627c protein in the first elution components was 1.03 mg/ml, and the purified Rv3627c protein was identified by SDS-PAGE.
Construction of 3. pVV16-Rv3627c expression vector and expression of Rv3627c protein in Mycobacterium Mycobacterium mc2155
The Rv3627c gene was cloned to the expression vector pVV16. by NdeI and HindIII, and mc2155 receptive cells were transformed by pVV16-Rv3627c expression vector, and 6 single colonies were selected to be inoculated into the 5 ml LB liquid medium containing Ka (n25mg/ml) and Tween8 (0 terminal concentration 0.05%), and cultured for 72 hours at 37 degrees, and then cultured in large volume. -Rv3627c bacteria. Collection, ultrasonic breaking bacteria, SDS-PAGE analysis of supernatant and precipitation components, but no expected protein bands.
Analysis of enzyme activity of 4. Rv3627c protein
The enzymatic reaction was designed by extracting the cell wall peptide of mc2155p/VV16-Rv3627c and wild type mc2155 cell wall. The results of the reaction were detected by paper chromatography. It was concluded that the protein expressed by Rv3627c gene of Mycobacterium tuberculosis may have carboxypeptidase activity.
Conclusion: in this study, we constructed pET29b-Rv3627c and pVV16-Rv3627c expression vectors respectively, and expressed Rv3627c protein in Escherichia coli BL21 (DE3) and C41 (DE3) respectively. Then, we identified and functional analysis of Rv3627c protein to speculate that it might have carboxypeptidase activity. This study results in our in-depth study of tuberculosis branching. The metabolic mechanism of the cell wall of bacilli laid the foundation.
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R378;Q78

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