人胰岛素样生长因子1受体β结构域蛋白的原核表达及活性检测

发布时间：2018-08-29 09:46

【摘要】：目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体。重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,最后用GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知蛋白表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)的相互作用。结果构建得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序后与目的序列一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,并经过Western blot检测,融合蛋白成功表达;纯化得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD两个融合蛋白,GST pull-down证明蛋白GST-IGF1Rβ-PKD可以和MEMO相互作用。结论成功克隆GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因,并获得活性良好的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD蛋白。
[Abstract]:Objective to construct the prokaryotic expression vector of extracellular domain (ED) and intracellular kinase (PKD) domain of human insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) 尾 subunit, obtain purified GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD fusion protein, and detect their activity. Methods the coding sequences of IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD genes were amplified by PCR from mammary cDNA library and inserted into pGEX-KG vector correctly. After the recombinant plasmid was transformed into E. coli Rossate expression, the fusion protein was purified by GST-Sepharose 4B beads, and the fusion protein was detected by Western blot method. Finally, the interaction of purified protein with known epidermal growth factor receptor 2 (EGF 2) driven cell motility regulatory protein (MEMO) was detected by GST pull-down technique. Results the prokaryotic expression vectors of GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD genes were constructed and identified by double enzyme digestion. The fusion protein was successfully expressed by Western blot, and the two fusion proteins GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD were purified, which proved that GST-IGF1R 尾 -PKD could interact with MEMO. Conclusion GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD genes were cloned successfully and GST-IGF1R 尾 -Ed and GST-IGF1R 尾 -PKD proteins were obtained.
【作者单位】： 大连医科大学生物工程研究所;军事医学科学院生物工程研究所;第二炮兵总医院;军事医学科学院科技部;
【基金】：国家自然科学基金(81472589,31100604) 北京市科技新星计划(Z141102001814055) 军事医学科学院创新基金转化医学项目(ZHYX003) 北京市自然科学基金(7132155)
【分类号】：R392-33

【参考文献】

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【共引文献】

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