线粒体途径在幽门螺杆菌VacA诱导胃黏膜上皮细胞凋亡中的作用

发布时间：2018-09-14 09:16

【摘要】： 目的:本研究初步探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)空泡毒素单一毒力决定簇对GES-1胃黏膜上皮细胞凋亡的影响,为进一步研究H. pylori的致病机制奠定基础。 方法:将本课题组已构建的pDsRed-Monomer-C1/VacA N端真核表达载体转染至GES-1细胞中,Western-blot鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄取试验检测GES-1细胞的空泡样变;Hoechst33342染色、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒以及电镜观察细胞凋亡情况,同时采用分光光度法检测细胞Caspase-9、Caspase-3的活化程度,罗丹明123检测细胞跨膜电位的变化, ELISA法检测细胞色素C的释放。 结果:重组质粒pDsRed-Monomer-C1/VacA转染GES-1细胞后,显示有特异性表达条带,24h后电镜下可明显观察到空泡样变及核固缩、染色质边聚等凋亡特征;重组质粒组中性红摄取量明显升高,与对照组相比差异有统计学意义(P 0.05)。Hoechst33342染色后镜下可见明显的核染色质浓缩,转染24h后Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测发现重组质粒组细胞凋亡率明显高于对照组(P 0.05)。Caspase-9和Caspase-3活化程度呈时间依赖性增加,分别在12h和24h达到峰值。Rho123染色发现线粒体跨膜电位明显降低,同阴性对照组相比有统计学意义(P 0.05)。重组质粒转染组释放细胞色素C的浓度呈时间依赖性正相关,与空质粒组及对照组相比差异有统计学意义(P 0.05)。 结论: 1. VacA蛋白瞬时高表达可诱导GES-1细胞凋亡及空泡样变。 2. VacA蛋白可激活Caspase-9和Caspase-3,且可能主要通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡。
[Abstract]:AIM: To investigate the effect of single virulence determinant of vacuole toxin of Helicobacter pylori (H. pylori) on apoptosis of gastric epithelial cells of GES-1, and to lay a foundation for further study of the pathogenesis of H. pylori.
METHODS: The pDsRed-Monomer-C1/VacA N-terminal eukaryotic expression vector constructed by our team was transfected into GES-1 cells, and the expression of VacA protein was identified by Western-blot; the vacuole-like changes of GES-1 cells were detected by electron microscopy and neutral red uptake test; Hoechst 33342 staining, Annexin V-FITC apoptosis detection kit and electron microscopy were used. Cell apoptosis was detected by spectrophotometry. The activation of Caspase-9 and Caspase-3 was detected by spectrophotometry. The changes of transmembrane potential were detected by Rhodamine 123. The release of cytochrome C was detected by ELISA.
Results: After transfection of recombinant plasmid pDsRed-Monomer-C1/VacA into GES-1 cells, specific expression bands were found. After 24 hours, the apoptotic characteristics such as vacuole-like degeneration, nuclear condensation and chromatin margin aggregation were observed under electron microscopy. The uptake of neutral red in recombinant plasmid group was significantly increased, and the difference was statistically significant compared with the control group (P 0.05). The apoptosis rate of the recombinant plasmid group was significantly higher than that of the control group (P 0.05). The activation of Caspase-9 and Caspase-3 increased in a time-dependent manner and reached the peak at 12 h and 24 h respectively. Rho123 staining showed that the mitochondrial transmembrane potential decreased significantly. The concentration of cytochrome C released by recombinant plasmid transfection group was positively correlated in a time-dependent manner, and there was significant difference between the empty plasmid group and the control group (P 0.05).
Conclusion:
1. transient high expression of VacA protein can induce apoptosis and vacuolar transformation of GES-1 cells.
2. VacA protein can activate Caspase-9 and Caspase-3, and may induce apoptosis of GES-1 cells mainly through mitochondrial pathway.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

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本文编号：2242260