大肠杆菌表达的新一代重组人内皮抑素复性条件的优化

发布时间：2018-09-18 16:36

【摘要】： 目的：优化重组人血管内皮细胞生长抑制素(rhED)的复性方案,以提高其复性率,并初步检测复性后rhED抗血管生成的生物活性,为rhED的进一步研究与利用提供大量的有活性的rhED蛋白。方法：用带有rhED cDNA的pQE3表达载体转染大肠杆菌E.ColiM15,在IPTG的诱导下发酵产生rhED包涵体并提取rhED包涵体。复性时,先用6mol/L盐酸胍溶解提取后rhED包涵体,在适宜的尿素浓度下稀释蛋白液并搅拌足够长的时间,结合逐级透析法进行复性,找出复性的主要影响因子,并优化最适复性条件。然后,利用标准曲线法测量rhED的浓度,SDS-PAGE验证并计算复性得率。复性结束后阳离子交换层析纯化rhED并超滤浓缩至适宜浓度。最后,用rhED特异性单克隆抗体和鸡胚绒毛尿囊膜抑制血管生长实验检测复性后蛋白的活性。结果：1L的rhED菌种发酵液能产生15g rhED包涵体。通过优化复性条件,rhED的复性率可达到46%。其中有三大重要的复性影响因素——复性时蛋白液的浓度、尿素浓度及pH值。复性时蛋白的浓度为0.3mg/ml、尿素浓度为3.5mol/L及pH为8时是适宜的复性条件。而阳离子交换层析能很好的纯化复性后的rhED。通过复性、纯化后的rhED能与rhED特异性单抗反应,并在鸡胚绒毛尿囊膜抑制血管生长实验中显示出抑制血管生长的活性。结论：至此提高rhED复性率的复性条件已经确立,本复性方案将极大地促进rhED的临床前研究及临床研究。
[Abstract]:Aim: to optimize the renaturation of recombinant human vascular endothelial cell growth inhibitor (rhED) in order to increase its renaturation rate, and to detect the anti-angiogenic bioactivity of rhED after refolding. To provide a large number of active rhED proteins for the further study and utilization of rhED. Methods: E. Coli M15 was transfected into E. Coli M15 by pQE3 expression vector with rhED cDNA. RhED inclusion bodies were produced by IPTG induction and rhED inclusion bodies were extracted. During renaturation, the inclusion bodies of rhED were extracted with 6mol/L hydrochloric acid guanidine hydrochloride, diluted with the protein solution at the appropriate urea concentration and stirred for a long time. The main influencing factors of renaturation were found by combining with the method of step by step dialysis. The optimum renaturation conditions were optimized. Then, the concentration of rhED was measured by standard curve method and SDS-PAGE was used to verify and calculate the renaturation yield. After renaturation, rhED was purified by cation exchange chromatography and concentrated to the appropriate concentration. Finally, rhED specific monoclonal antibody and chicken chorioallantoic membrane inhibition vascular growth test were used to detect the activity of renatured protein. Results 15 g rhED inclusion bodies could be produced in the fermentation broth of rhED strains at 1: 1 L. By optimizing the renaturation conditions, the renaturation rate of rhED can reach 46%. There are three important factors affecting renaturation: the concentration of protein solution, the concentration of urea and the value of pH during renaturation. The optimal renaturation conditions were protein concentration of 0.3 mg / ml, urea concentration of 3.5mol/L and pH of 8. And cationic exchange chromatography can purify rhED. after renaturation. By renaturation, the purified rhED could react with rhED specific monoclonal antibody, and showed the activity of inhibiting angiogenesis in chorioallantoic membrane of chicken embryo. Conclusion: the renaturation conditions for increasing the rate of rhED renaturation have been established, and this renaturation scheme will greatly promote the preclinical and clinical study of rhED.
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R346

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