HBsAg的单克隆抗体制备、表位分型及其应用研究

发布时间：2018-10-08 11:38

【摘要】： 临床上,通过检测HBV血清标志物来辅助判断HBV感染与否、评价预后、治疗方案和药物反应等。HBsAg是感染HBV后最早出现在血液中的标志物之一,通常在肝脏组织产生生化指标异常或表现出黄疸症状前2-8周即可在血液中检测到HBsAg。因此,在血液筛查和临床诊断中,HBsAg是检测HBV感染情况的首选指标。HBsAg由HBV的S基因编码,根据HBsAg表面抗原决定簇的不同,可以将其分为不同亚型,主要包括：adw、adr、ayw和ayr。共同决定簇“a”存在于所有HBsAg,而d/y,w/r是两对互斥决定簇。不同亚型具有明显的地理分布特点,并且与疾病的发生发展呈一定相关性,HBsAg血清型的临床意义也是当前HBV研究的热点之一。在今后的HBV检测项目中,如果能够同时对HBsAg亚型进行鉴定,将为疾病的治疗方案和预后判断提供非常有价值的参考。共同决定簇“a”存在于所有HBsAg中,因此成为免疫检测和疫苗设计的最佳靶点。 HBsAg的检测方法有很多,主要是基于抗原-抗体反应的夹心ELISA方法。该方法具有成本低、操作简单、适用于大规模筛选等优点,是目前最为常用的检测方法。近年来,相继有新的检测方法与技术问世,包括微粒子酶免疫分析、化学发光免疫分析等方法。总体而言,特异性好且敏感性高的HBsAg单克隆抗体始终是各种方法与技术发展的基础与前提。本研究着眼于我国HBsAg检测水平与目前存在的问题,探讨了高敏感性高特异性HBsAg单克隆抗体的制备与应用,同时对HBsAg亚型单抗的制备进行了初步探索,主要包括以下三个方面的内容： 1. HBsAg共同决定簇“a”单克隆抗体的制备。分别用抗原HBsAg-ay和HBsAg-ad免疫两组Balb/C小鼠,3次免疫之后检测小鼠血清中HBsAg-ay或HBsAg-ad特异性抗体效价。选择血清抗体效价较高的小鼠作为脾细胞来源,利用PEG作为融合剂将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。经筛选获得阳性杂交瘤细胞,利用有限稀释法进一步分选出分泌单一表位抗体的杂交瘤细胞,最终获得5株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。对HBsAg-ay和HBsAg-ad抗原免疫获得的抗体进行交叉验证,筛选出共同决定簇“a”特异性抗体3株,分别为命名为#3-11-2、#3-16-1和#6-2-2。 2.共同决定簇“a”特异性抗体的功能分析与应用研究。对2株亲和力较好的抗体进行亚型鉴定发现,#3-11-2为IgG2a,K轻链；#6-2-2为IgGl,K轻链。利用竞争ELISA方法对各抗体进行表位鉴定。以特异性强、亲和力好为原则从中选择出一组不同表位抗体,通过优化参数,确立了一个最佳的HBsAg检测体系：0.8μg/mL #6-2-2包被,1：10,000稀释#3-11-2-HRP的检测效果最为理想。以市场上广泛认可的试剂盒阳性对照品作为样本,检测本体系的有效性和灵敏性。进一步利用优选的一对#6-2-2和#3-11-2-HRP建立夹心ELISA检测HBsAg方法,对正常人和乙肝患者血清标本进行检测,并且与临床医院应用的检测方法进行比较,本研究中建立的体系表现出较好的实际应用能力。 3.初步探索HBsAg血清型单克隆抗体的制备。在前期共同决定簇“a”特异性单抗制备工作的基础上,探索HBsAg亚型单抗的制备。在第一部分中,HBsAg-ay和HBsAg-ad抗原免疫筛选到共同决定簇“a”特异性抗体的同时,还有一部分抗体能且仅能与免疫抗原相互作用,在HBsAg-ay和HBsAg-ad之间无显著交叉反应。说明这些抗体是特异性识别“y”或“d”表位的。以此为原理,筛选到2株HBsAg "y"特异性单克隆抗体。
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【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】