利用RNAi技术研究人胚胎干细胞特异性表达新基因HESRG功能

发布时间：2018-10-10 11:18

【摘要】： 人胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)是从植入前早期胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)中分离得到并能在体外长期培养的高度未分化的全能细胞系。在体外特定的、适宜的培养体系中,人ES细胞可接近无限增殖,并保持未分化状态和多向分化潜能。ES细胞为研究胚胎早期发育的分子机制提供了良好的细胞模型,切其经合适的条件诱导可分化为外胚层、中胚层和内胚层三个胚层来源且其经合适的条件诱导可分化为外胚层、中胚层和内胚层三个胚层来源的各种细胞,如神经细胞、心肌细胞、胰岛细胞和造血细胞等,因而有望成为神经退行性疾病、心肌梗塞、糖尿病和血液病等疾病移植治疗的重要种子细胞,具有重要的研究价值和应用前景。人ES细胞系首先是由Thomson等和Shamblott等于1998年分别从ICM和PGCs建立,此后一直是生物学和医学研究领域的热点。 ES细胞的一个重要的特点就是具有自我更新能力,即细胞通过对称分裂在维持全能性不丢失的情况下扩增细胞数目。ES细胞自我更新能力的维持是体外培养、扩增ES细胞的必要条件,也是ES细胞在科学和临床应用的基础。深入研究ES细胞自我更新机制具有重要意义,这也是当前ES细胞研究领域的重点和热点。过去的研究表明,多种因素参与调控人ES细胞自我更新,其中包括转录因子(Oct-3/4、Nanog、Sox2等)、信号通路(TGFβ信号通路、Wnt信号通路、FGF和PI3K信号通路等)、细胞周期调控因子、microRNA、染色质重塑及DNA甲基化等。Oct-3/4、Nanog、Sox2是目前研究较多的参与调控人ES细胞自我更新的转录因子,它们之间可相互作用形成复杂的转录调控环路,共同维持人ES细胞的多潜能性。除此之外,近来研究表明人ES细胞中还存在其它已知或未知基因参与其自我更新的调控过程,然而它们在人ES细胞中的功能及调控机制仍需要深入研究。本室在前期工作中通过用全基因组芯片比较未分化的人ES细胞(H9细胞)和7天拟胚体(7-day embryoid bodies,7-day EBs)的差异基因表达谱,发现一个EST序列(Genbank:BF223023)在未分化的人ES细胞中高表达,而一旦细胞分化后其表达显著降低(下调达20倍),经RT-PCR和real-time PCR得以证实。进一步通过EST拼接、5'-RACE等方法首次克隆得到一个只在未分化人ES细胞中高表达而在其它多种组织或细胞中均检测不到表达的人胚胎干细胞特异性表达新基因,我们将该基因命名为HESRG (human embryonic stem cell related gene, HESRG),其在国际基因序列数据库GenBank登录号为DQ445779。除本室外,目前国内外尚未见该基因相关研究的报道。 HESRG基因定位于人染色体3p14.3,基因组跨越6921bp,含有4个外显子和3个内含子,其cDNA全长3141bp。将HESRG基因序列在NCBI核酸数据库中进行同源性比较,仅发现其与黑猩猩(Pantroglodytes)、恒河猴(Macaca mulatta)等灵长类动物部分序列同源。通过融合基因表达策略、Western Blot和免疫组化检测等手段,本室前期工作已确定HESRG基因开放阅读框(ORF)长669bp,编码222个氨基酸,包含一个核定位信号及一个亮氨酸拉链结构域,蛋白定位在细胞核内,提示HESRG可能在人ES细胞中发挥转录因子的作用。本室前期工作还发现过表达HESRG可促使人ES细胞向中胚层方向分化；使用化学合成siRNA干扰HESRG结果初步显示HESRG基因的表达下调后人ES细胞呈现出分化细胞的表型,提示HESRG基因可能在人ES细胞自我更新中起重要作用。本研究拟在上述研究基础上,进一步利用化学合成siRNA、慢病毒RNAi载体和可诱导RNAi技术等多种手段全面研究人ES细胞中HESRG的功能。 [检测HESRG特异性表达及其亚细胞定位] 通过RT-PCR检测在小鼠ES细胞和人ES细胞的HESRG mRNA水平表达,结果显示只在人ES细胞检测到.HESRG,在小鼠ES细胞未检测到HESRG表达。通过生物信息学方法(JW方法)筛选找到HESRG蛋白抗原表位,合成特异性多肽,然后将其C末端氨基酸偶联匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH),免疫新西兰大白兔,每只均经过四次免疫,采集兔免疫血清,亲和层析纯化,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定抗体效价,由此制备了HESRG特异性抗体。随后,我们利用HESRG抗体采用间接免疫荧光检测HESRG在小鼠ES细胞和人ES细胞的表达,结果显示在小鼠ES细胞未检测到HESRG蛋白表达,在人ES细胞检测到表达,荧光信号定位于细胞核,结合实验室前期对HESRG的表达分析,进一步证实HESRG是人ES细胞特异性表达基因,可能作为转录因子起作用。 [利用化学合成siRNA人ES细胞特异性表达基因] 化学合成针对HESRG的siRNA,转染人ES细胞,通过相差倒置显微镜观察细胞形态学变化。转染24小时,人ES细胞变得分散、扁平,开始分化；转染48小时细胞分散、细长,出现丝状物,似神经前体细胞表型；转染72小时,细长、丝状物更加明显,细胞形态仍似神经前体细胞表型,但是部分细胞开始死亡。收集细胞,抽提RNA,通过RT-PCR在mRNA水平检测.HESRG基因、人ES细胞多潜能标志基因(Oct4、Nanog)、神经外胚层标志基因(Nestin、Musashi1、FGF5、Sox1)、中胚层标志基因(BRACHYURY(T)、Hand1)、内胚层标志基因(GATA6、AFP)、滋养外胚层标志基因(CGa),检测结果显示抑制HESRG表达以后人ES细胞多潜能性标志基因Oct4、Nanog表达均出现显著下调；而神经外胚层分化标志基因Nestin表达显著出现上调、Musashil表达上调,未检测到其它胚层标志基因表达。随后,我们采用间接免疫荧光方法蛋白质水平检测HESRG、多潜能性标志分子Oct4及各胚层分化标志分子(Nestin、Musashi1、Hand1、GATA6、CGa)的表达情况,检测结果显示HESRG、Oct4表达在干扰后的细胞中显著下调,而神经外胚层标志分子Nestin的表达显著升高,Musashi1表达水平升高。我们的实验结果从细胞形态、基因转录和蛋白水平三方面证明在HESRG基因表达被显著抑制后,人ES细胞向神经外胚层分化,表明HESRG可能抑制人ES细胞向神经外胚层分化,参与人ES细胞自我更新。 [利用慢病毒干扰载体研究HESRG基因功能] 首先构建HESRG基因的慢病毒干扰载体：将siRNA insert (shHESRG)插入慢病毒shRNA表达载体pRNATin-H1.4/Lenti中,通过电泳酶切和测序鉴定,shHESRG慢病毒表达载体构建正确,命名为pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG。该载体的启动子是包含两个TetO元件的H1.4启动子。当不存在其反式调控因子四环素阻遏蛋白(TetR)时,H1.4启动子可以像常规的H1启动子一样启动shRNA的表达,进而下调目的基因的表达。为了获得较高的慢病毒载体转染人ES细胞的效率,我们首先采用了受EF1α启动子(该启动子在人ES细胞中具有较强的活性)调控的报告基因(增强型绿色荧光蛋白基因,EGFP)的慢病毒表达载体(pHAGE2-EF 1 aFull-ZsGreen-W)来摸索慢病毒包装和转染人ES细胞的合适条件。采用阳离子脂质体法进行病毒包装,将pHAGE2-EF1αFull-ZsGreen-W 10μg、pMD2.G 5μg、psPAX2 7.5μg共转染293FT细胞,72小时后收集病毒上清,3000rpm离心15分钟去除细胞碎片,超速离心浓缩病毒上清。将浓缩后的病毒颗粒感染人ES细胞,72小时左右可观察到绿色荧光信号,感染效率与克隆的大小有一定关系,成功感染pHAGE2-EF1αFull-ZsGreen-W的人ES细胞绿色荧光信号并没有随着传代而消失,表明慢病毒颗粒携带EGFP表达稳定持久。采用同样的方法进行pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG包装和感染人ES细胞。感染病毒颗粒的第五天左右可以观察到人ES细胞变得分散、细长,似神经前体细胞形态。收集细胞,提取RNA,通过realtime-PCR检测mRNA水平上HESRG基因、多潜能标志基因及各胚层标志基因的表达改变。间接免疫荧光检测检测HESRG、多潜能性标志分子Oct4及各胚层分化标志分子(Nestin、Musashi1、GATA4、Hind1、CGα)表达情况。Realtime-PCR和间接免疫荧光结果与瞬时转染siHESRG结果一致。 [可诱导RNAi方法研究HESRG基因功能] 四环素(tetracycline)诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统,该系统具有严密、高效、可控制性强的优点。该系统可分为"Tet-off"和"Tet-on"系统,其中"Tet-on"系统由于诱导的可控性更强而应用更广泛。"Tet-on"系统可受到四环素衍生物强力霉素(doxycycline, Dox)严格调控,由调节质粒和反应质粒组成,调节质粒可表达TetR阻遏物,而反应质粒包含四环素反应元件(Tet responsive element, TRE),如’TetO。在没有Dox存在的情况下,TetR可以与TRE结合,抑制启动子活性,关闭下游目的基因或shRNA的表达；而加入Dox后,Dox可以与TetR阻遏物结合,使之不能与TRE结合,从而使下游目的基因或shRNA高效表达。已有研究报道表明"Tet-on"可诱导系统能够有效地应用在人ES细胞中。鉴于HESRG表达被干扰后导致人ES细胞向神经外胚层细胞分化,我们拟进一步利用"Tet-on"系统在人ES细胞中建立一个可诱导的HESRG特异性的shRNA表达系统,然后再精密调控HESRG表达水平,以详细研究HESRG在细胞自我更新和分化中的作用。首先建立表达TetR的人ES细胞系。通过转染TetR表达质粒(pCAG-TetRnls)于H9人胚胎干细胞系,加入puromycin (2μg/ml)进行筛选得到抗性克隆。采用RT-PCR检测TetR mRNA表达水平,Western Blot检测TetR蛋白表达水平；从细胞形态、细胞表面未分化抗原(TRA-1-60、SSEA-3)、多潜能标志物、碱性磷酸酶(AKP)、细胞分化潜能(体外实验)对TetR表达水平最高的人ES细胞克隆进行鉴定。结果显示,我们获得了高表达TetR的人ES细胞系并命名为H9-TetR, H9-TetR和H9细胞系一样具有多潜能分化和自我更新特性,可以用于进一步实验。稳定表达TetR的人ES细胞系构建成功,为在人ES细胞建立可诱导干扰系统奠定了基础。如前所述,pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG载体的inH1.4启动子包含TetO元件。当存在TetR阻遏物时,TetR可以与TetO元件结合,抑制H1启动子活性,从而关闭shRNA表达,而四环素或四环素衍生物Dox则能与TetR结合并去除TetR对H1启动子的抑制,从而启动shRNAs的表达。将浓缩的pRNATin-H1.4/Lenti-shHESRG病毒颗粒感染H9-TetR细胞。与前面转染空白H9细胞导致其发生分化的情况不同,转染的H9-TetR细胞形态未发生变化,仍呈紧密、克隆状生长。加入G418筛选,挑克隆扩大培养,获得稳定的细胞克隆,命名为H9-TetR-shHESRG细胞。然后,加入Dox (1μg/ml浓度)诱导H9-TetR-shHESRG细胞中HESRG shRNA的表达,48小时后,细胞变得分散、细长,开始分化；而未加Dox诱导的H9-TetR-shHESRG细胞仍呈紧密克隆状生长,说明我们已初步在人ES细胞建立了可诱导干扰系统。综上所述,本研究从mRNA和蛋白质水平检测到HESRG在人ES细胞特异表达,其蛋白表达定位于细胞核。利用化学合成siRNA、慢病毒shRNA表达载体和可诱导shRNA系统等三种RNAi技术手段成功地抑制了HESRG表达,且均观察到HESRG表达下调可导致人ES细胞向神经外胚层分化,表明HESRG新基因可以通过抑制神经外胚层分化维持人ES细胞自我更新。此外,我们已初步在人ES细胞中建立了HESRG新基因的可诱导干扰系统,为进一步深入研究该新基因在人ES细胞中起作用的分子机制及人ES细胞自我更新机制奠定了坚实的基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【引证文献】