人磷酸核糖焦磷酸合成酶（hPRS）致痛风病突变体及人黑色素瘤分化相关抗原5（MDA5）的结构和功能研究

发布时间：2018-10-15 08:16

【摘要】： 1、人源磷酸核糖焦磷酸合成酶(hPRS1)致病突变蛋白和hPRS2蛋白的结构和功能研究 人源5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(hPRS, E.C. 2.7.6.1)催化5磷酸核糖(R5P)和三磷酸腺苷酸(ATP)反应生成腺苷酸(AMP)和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP),是体内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸代谢的重要调节酶。人类的prs基因编码三种hPRS蛋白:hPRS1、hPRS2和hPRS3。至今已有7例在原发性痛风病人体内发现的hPRS1蛋白点突变,且均发现突变导致的酶活性上升是痛风的发病原因。hPRS1的晶体结构已被人发表,但其突变体导致活性升高的结构基础研究尚空缺。hPRS2与hPRS1一样在所有组织都有表达,目前未有研究发现hPRS2与痛风发病的关系,它如何影响PRS在胞内活性的有待研究。本研究完成了重组hPRS1蛋白,7个hPRS1点突变蛋白及hPRS2蛋白的表达和纯化。在分子筛过程中发现目的蛋白存在多种聚集状态,故通过动态光散射和沉降系数分析等实验检测各蛋白的聚集状态及其在添加底物后的聚集态的变化情况。同时应用圆二色谱分析了hPRS1蛋白和2个hPRS1点突变蛋白的二级结构和底物、抑制剂对蛋白二级结构的变化等。此外酶活性测定发现hPRS1点突变蛋白比活性略高于母体蛋白,而hPRS2与hPRS1混合后蛋白比酶活性比二者单独的都低。在以上实验基础上,通过分析母体蛋白的晶体结构,提出了关于其中两个hPRS1突变体蛋白的可能的结构变化以及该种变构如何影响蛋白活性的机理。hPRS1突变体蛋白及hPRS2的晶体生长仍在进行中,部分已得到针晶在优化筛选中。　　　　 2、人黑色素瘤分化相关抗原5(MDA5)各功能片段的表达、纯化和初步晶体学研究　　 黑色素瘤细胞分化相关抗原5(MDA5)是天然免疫系统中近几年才被发现的重要模式识别受体,　能够在细胞胞浆内特异性识别一些特定RNA　病毒的RNA,通过不依赖于TLR3　的方式诱导Ⅰ型IFNs,从而诱导具有抗病毒作用的1型干扰素的生成。　MDA5具有N　端2个激活下游蛋白的CARD(Caspase　recruitment　domain)结构域,dsRNA　结合的DExD/H　box　RNA　解旋酶结构域(Helicase　Domain)及C端的自身抑制结构域(Self-repression　Domain)。病毒的双链RNA被Helicase结构域识别后,蛋白发生变构暴露CARD结构域,通过激活病毒诱导的信号转导蛋白(Virus-induced　signaling　adaptor)传导信号。最近MDA5非常受关注,但其结构学研究尚不完善。本研究以进行晶体结构解析的研究以及免疫学实验为目的,开展了对MDA5各功能结构域的蛋白片段的质粒构建、表达和纯化工作。总共尝试了10个重组蛋白片段的E.coli表达,其中8个蛋白没有表达,有2个蛋白表达为包涵体,其中的一个片段Helicase　ATP　Binding　Domain通过变复性获得少量蛋白,但稳定性较差,后经过序列改造后该片段在上清中有少量表达,经过纯化纯度达到95%以上。实验发现该蛋白因二硫键引起的聚集严重,因而稳定性较差,对于它的晶体生长工作仍在进行中。　　
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R589.7;R392

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本文编号：2271927