裂褶菌培养基形态学观察及致病性的动物试验研究

发布时间：2018-10-15 09:22

【摘要】： 目的:裂褶菌龴Schizophyllum commune㖞属真菌门,担子菌纲,伞菌目,裂褶菌科,裂褶菌属,广泛分布于世界各地。该菌多寄生于腐木上,是林木常见的致病真菌。在对人类致病性方面,临床上以吸入其孢子引起过敏反应较为常见,而由该菌引起人体深部组织感染病例罕见,但近年来国外有关该菌引起人体深部组织感染的报道逐渐增多。本研究所用菌株分离自我科会诊病人的痰液,经中国科学院微生物研究所鉴定为Schizophyllum commune。本研究一方面通过对裂褶菌在五种不同培养基上的形态学特征进行观察,寻找更适合其生长的培养基,为临床上诊断裂褶菌感染提供实验室依据;另一方面,采用动物实验的方法,将裂褶菌悬液分别经皮下、腹腔及静脉途径接种于不同免疫状态的小鼠体内,观察小鼠28天内的死亡率,并通过组织真菌逆培养、组织载菌量测定及组织病理学等检查,比较不同免疫状态下小鼠心肝脾肺和肾等主要脏器的感染程度,为进一步了解此菌的致病力及其引起的组织病理学改变提供实验室依据。方法:1 DNA序列分析提取分离菌DNA,PCR扩增其26SrDNA近5’端D1/D2区域,在DNA自动测序仪上进行直接双向测序确定碱基位点,通过GenBank/EMBL/DDBJ核酸序列数据库进行同源序列检索,通过系统树显示其亲缘关系。 2菌落形态学观察 2.1五种平皿培养基上菌落大体形态学观察将我科保存菌株常温复苏3天,分别接种于沙堡氏琼脂培养基龴SDA㖞麦芽浸膏琼脂龴MEA㖞马铃薯葡萄糖琼脂龴PDA㖞玉米粉琼脂龴CMA㖞和察氏琼脂龴CZA㖞上,分别置于27℃和37℃恒温箱培养2周,观察菌落生长情况测量菌落直径并绘制生长曲线。 2.2小培养龴方块法㖞将裂褶菌分别点种于以上五种培养基的小培养上,27℃和37℃恒温箱培养2周,观察菌丝生长产孢情况。 2.3光镜观察取五种培养基生长良好的菌落标本置于载玻片上,经乳酸酚棉兰染色,光镜下观察。 2.4扫描电镜观察取SDA培养基两个温度下培养7天的菌落标本,置于4%的戊二醛中固定,常规制片后在扫描电镜下观察。 3生理学实验 3.1尿素酶试验将菌落接种于尿素琼脂培养基上,室温培养1周,观察培养基变色情况。 3.2放线菌酮抑制试验将菌落分别接种于含有放线菌酮和不含放线菌酮的沙堡琼脂培养基上,27℃和37℃恒温箱培养2周,观察菌落生长情况。 4动物的致病性试验 4.1裂褶菌系统感染动物模型的制作将保存菌株复苏,转种于SDA培养基上37℃培养7天。用无菌生理盐水制备成菌悬液,通过皮下、腹腔、静脉三种途径接种至不同免疫状态的小鼠。 4.2死亡率观察连续观察各组小鼠感染该菌后28天内的自然死亡情况,记录死亡日期和死亡只数。 4.3感染内脏大体观察将不同感染时间的小鼠分批处死进行解剖,分别取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏,观察各脏器是否肿大或萎缩、有无颜色改变等大体形态改变。 4.4组织真菌逆培养无菌条件下将各脏器用组织研磨器研碎后挑取少许分别接种于含沙堡氏琼脂培养基的试管中,37℃恒温箱培养一周,统计各组小鼠内脏逆培养阳性数。培养阳性的菌落分别移种至平皿培养基及小培养的培养基上培养,观察其菌落形态以及菌丝和孢子的形态。 4.5脏器真菌载菌量测定无菌条件下取小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏,匀浆后分别进行组织的真菌平皿培养,计算各脏器的真菌载菌量。 4.6组织病理学检查切取接种菌悬液小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等脏器,用10%福尔马林溶液固定,常规脱水、透明、包埋、切片,进行HE和PAS染色,光镜下观察其组织病理学改变。结果: 1 DNA序列分析结果基于26SrDNA D1/D2区序列和Neighbor-Joining分析绘制的系统树,示该菌株与Schizophyllum commune具有的100!同源性。 2五种培养基菌株的大体形态学观察五种培养基上均有菌落生长,菌落均为蓬松的白色羊毛状。菌落在沙堡氏琼脂培养基龴SDA㖞麦芽浸膏琼脂培养基(MEA)马铃薯琼脂培养基龴PDA㖞上第1周生长速度较快;在察氏培养基(CDA)玉米琼脂培养基龴CMA㖞上生长速度略慢。 3五种培养基上菌落直径裂褶菌在五种培养基上第1周生长较快,生长速度与时间呈正比。同一温度菌落生长第7天和第14天时,不同培养基菌落直径比较无显著性差异(P 0.05);同一种培养基在37℃菌落直径均较27℃大,有显著性差异(P 0.05)。 4光镜下观察可见发达的分枝分隔菌丝,菌丝直径差别较大,在分隔处可见闭锁联合。在菌丝表面上常常发现侧生钉状突起。SDA培养基上可见类水母状变异体;担孢子呈长圆型。 5扫描电镜观察可见发达的分枝分隔菌丝,在分隔处产生闭锁联合。在菌丝表面上可见较多短且弯曲的侧生的钉状突起及泪滴状或球形分泌,未见孢子。 6生理学实验尿素酶试验阳性;放线菌酮耐受试验阴性。 7小鼠感染后生存状况免疫正常小鼠接种裂褶菌后,其生活习性无明显改变。皮下接种组小鼠背部接种部位出现一结节。免疫抑制腹腔组及免疫抑制静脉组小鼠的进食量明显减少,并逐渐消瘦。 8小鼠感染后的死亡情况免疫抑制静脉组在接种后第4达到死亡高峰,至16天止,死亡率高到85!;免疫抑制腹腔组在接种该菌后3天开始出现死亡,第6天达到高峰,至12天止,死亡率为35!;其余各组均无自然死亡。免疫抑制静脉组及免疫抑制腹腔组小鼠的死亡率及平均存活天数有显著性差异(P 0.05)。 9脏器的大体改变部分免疫抑制腹腔组和静脉组小鼠脏器表面可见白色化脓性病灶,其中以肝脏表面脓灶为多见。其它各组小鼠各脏器无明显大体改变。 10组织真菌逆培养小鼠内脏组织培养3天后见部分脏器有菌落生长,其菌落形态及镜下形态均与接种的菌株相同。 11脏器真菌载菌量无论免疫正常还是免疫抑制状态下,腹腔注射组肝脏和脾脏感染程度较重,与肺脏心脏和肾脏相比较有显著性差异(P0.05);静脉注射组肝脏感染程度最为严重,与其它脏器比较有显著性差异(P0.05)。 12肝脏真菌载菌量免疫抑制静脉组肝脏感染程度最为严重,与免疫抑制腹腔组、免疫正常静脉组和腹腔组相比较,有显著性差异(P0.05);免疫抑制腹腔组、免疫正常静脉组和腹腔组相比较,肝脏感染程度无显著性差异(P0.05)。 13组织病理学检查HE染色早期为急性炎细胞浸润,可见组织细胞变性坏死;后期可见组织细胞及多核细胞反应性增生及纤维组织增生。PAS染色可见炎症组织中紫红色分支菌丝。结论:1裂褶菌只有丝状型一种菌落形态,在沙堡琼脂培养基龴SDA㖞上生长状态较好,并且在37℃生长较27℃良好。裂褶菌尿素酶试验阳性;放线菌酮可抑制该菌生长。 2通过腹腔和静脉注射途径可以成功建立裂褶菌系统性感染小鼠模型。皮下注射接种则未见致系统性感染。 3裂褶菌引起的主要脏器的组织病理学改变为真菌感染的急慢性炎症,即非特异性炎症改变。免疫抑制状态小鼠更易引起感染,感染的程度也更重,说明裂褶菌一种条件致病性真菌,其致病力与机体免疫状态密切相关。 4无论何种免疫状态,肝脏为裂褶菌最易感染的器官;肾脏为较不易感染的器官。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R379

【参考文献】