安徽省产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌的耐药性与Ⅰ类整合子的研究

发布时间：2018-10-18 11:30

【摘要】： 目的: 了解安徽省产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药情况,耐药基因型别的分布,指导临床合理用药。了解新酶的生化特性,等电点和酶对抗菌药物的水解特性。了解产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌Ⅰ类整合子的流行情况,以及Ⅰ类整合子中基因盒的种类。材料与方法: 安徽省细菌耐药监测中心收集35所医院2007年随机月份住院和门诊患者的各种临床送检标本,无重复分离的E.coli共355株。全部菌株均由Microscan WalkAway-40全自动微生物分析仪(美国DADE公司)自动鉴定系统鉴定。 355株大肠埃希菌通过头孢西丁三维实验筛选出确证高产AmpC酶菌株,以三维试验阳性菌株总DNA为模板,使用blaampC通用引物进行PCR扩增以筛选出携带ampC基因菌株;将三维试验阳性菌株行转移接合试验,行全编码引物PCR扩增。并用琼脂平板稀释法测定其对13种抗菌药物的耐药性。对多次测序并经GenBank比对后确定的产新酶菌株进行以下实验:PCR扩增临床分离株和/或转移接合子中的AmpC型β-内酰胺酶编码基因片段,PCR产物纯化后克隆入pMD-18T载体,表达于感受态细胞大肠埃希菌JM109中,再次测定核苷酸序列,结果至GenBank比对,进行DNA序列分析。将新酶全编码基因克隆入表达载体pHSG398,转化于感受态细胞大肠埃希菌JM109中,用加有抗菌药物的琼脂平板进行转化株筛选。用琼脂倍比稀释法测定临床分离株和接合子,转化株的MIC。采用超声破碎法进行产新酶细菌转化株的粗酶提取,进行酶促反应动力学研究,以初步了解新酶的动力学特性。等电聚焦电泳测定其等电点(pI)。Southern blot实验进一步了解新酶是否为质粒介导。PCR筛选Ⅰ类整合酶基因,进一步检测阳性样本可变区基因盒序列。检测携带新型AmpC型酶菌株的整合子基因盒。结果: 355株大肠埃希菌中21株大肠埃希菌三维实验阳性,占所有临床分离菌株的5.9%(21/355),19株经PCR检测携带ampC基因,16株转移接合成功,经序列分析表明,9株CIT阳性结果,6株DHA阳性结果,3株EBC阳性结果;1株同时携带EBC及DHA。检出一株EBC型新基因(序列号为FJ237369);药敏结果显示临床分离菌株及接合子对多种抗菌药物耐药,对头孢吡肟,亚胺培南,美罗培南敏感。产新型质粒介导AmpC酶菌株的转移接合试验和克隆表达试验均取得成功,其野生株及转化株的MIC结果显示:野生株和转化株有着几乎相同的耐药谱,但转化株对抗菌药物的耐药性有所下降。产新型质粒介导AmpC酶细菌转化株的等电聚焦显示,其等电点在8.6左右,Southern blot实验提示新酶为质粒介导。酶促反应动力学研究,初步了解新酶对5种常用抗菌药物的Km值和Vmax值,结果显示:该酶对头孢西丁的水解效率最高。产质粒介导AmpC酶的大肠埃希菌中16株携带有I类整合子, 14株扩增出了可变区,经测序基因盒为编码磺胺类抗菌药物耐药的基因dhfrA17和编码氨基糖苷类抗菌药物耐药的基因aadA5, aadA1,aadB。ampC基因不在Ⅰ类整合子基因盒上。结论: 根据体外药敏实验结果判断,临床可选用第四代头孢菌素类抗菌药物,碳青酶烯类抗菌药物抗感染治疗。2007年安徽地区大肠埃希菌产质粒介导AmpC酶以CIT型和DHA型为主,另外,我们在世界上首次报道了一种新酶ACT-5(FJ237369)。产AmpC酶细菌中I类整合子检出率高,基因盒为编码磺胺类和氨基糖苷类抗菌药物耐药的基因。临床应加强抗菌药物的合理应用,以有效预防耐药菌株的产生及传播。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

【参考文献】