人工合成肺孢子菌p55蛋白串联基因的克隆表达及产物分析

发布时间：2018-10-24 19:26

【摘要】： 目的 肺孢子菌肺炎(Pneumosystis pneumonia PCP),是由肺孢子菌引起的一种机会感染性致命性肺炎。常见于AIDS、恶性肿瘤、器官移植及其他免疫功能不全的人群,随着艾滋病在世界各地的蔓延流行,器官移植的开展,免疫抑制剂的广泛应用,肺孢子菌的机会性感染将成为一个严重的公共卫生问题。因此,国内外有许多学者致力于PCP防治策略以及疫苗方面的研究,但是至今尚无理想的防治措施问世。肺孢子菌55 kDa蛋白(p55)是肺孢子菌的主要抗原成分之一,能刺激宿主产生抗肺孢子菌的保护性免疫反应。但是肺孢子菌体外培养困难而致p55抗原来源受限,多个p55蛋白变异体的出现又使免疫效果受到影响,这些都对利用p55抗原进行免疫防治研究十分不利。本实验是通过网络数据库结合生物软件分析的方法,分析p55蛋白可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用并具有较好抗原性参数的区域作为候选抗原表位,从5个p55蛋白变异体中共选取了十二个B细胞表位,将各表位进行串联后形成嵌合体,人工合成串联基因后进行体外表达,为PCP疫苗的深入研究提供实验依据。 方法 一、抗原表位预测 运用生物信息学方法对p55蛋白的二级结构,亲水性,穿膜螺旋,N-糖基化位点,氨基酸序列的亲疏水性,表面可及性,分子柔韧性及抗原性参数进行预测分析,设计抗原表位多肽。 二、基因合成和测序鉴定 设计多表位的串联基因,命名为TAG,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成及测序验证。 三、TAG串联基因原核表达载体的构建及鉴定 将该TAG基因克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pGEX-6p-1/TAG,受体菌为E.coli DH5α菌株。将该含有该重组质粒的菌株于37℃增菌,按照小量质粒提取试剂盒方法将过夜培养菌液提取质粒,应用限制性内切酶进行酶切,行琼脂糖凝胶电泳。 四、TAG串联基因的扩增及表达 将被证实的含有重组质粒pGEX-6p-1/TAG的E.coli DH5α,在LB液体培养基中37℃增菌,IPTG诱导其表达,将菌体变性后进行8%SDS-PAGE电泳。 五、Western Blotting分析 将表达目的蛋白和阳性对照GST蛋白的菌液离心后进行超声破菌,收集上清后100℃变性5min,8%SDS-PAGE电泳。45V,3h冰浴,转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉、0.1%BSA封闭2小时,以1∶500稀释浓度加入Anti-GST-Ab抗体,4℃过夜。PBST漂洗三次,加入HRP标记羊抗兔IgG,室温孵育2h,用DAB显色,30min内观察结果。 六、TAG表达蛋白的初步纯化 提取包涵体,1、2、4、6M尿素充分振荡、洗涤,将沉淀重悬含8M尿素的包涵体溶解缓冲液中于充分振荡溶解包涵体后,4℃离心,收取上清,将沉淀用PBS重悬。将上清、沉淀作Western Blotting分析后,确定最好的洗涤浓度进行大量纯化,以为下一步实验做好准备。 结果 一、抗原表位设计及基因合成 选取目前报道的肺孢子菌p55蛋白的5个变异体当中有效抗原位点,共选取了十二个B细胞表位,将各表位进行串联,人工合成串联基因,全长1180bp,命名为TAG。 二、重组质粒的构建及鉴定 将串联基因连接在原核表达载体pGEX-6p-1上,命名为pGEX-6p-1/TAG,该重组质粒经测序证明碱基序列及读码框架完全正确。此外该重组质粒用限制性内切酶BamHI,NotI消化,经0.8%琼脂糖凝胶电泳证实片段大小与预期吻合,质粒构建成功。 三、TAG在原核细胞中表达 携带重组质粒pGEX-6p-1/TAG的E.coli DH5α经IPTG诱导表达后,8%SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白为分子量为69KD的GST融合蛋白,并出现于包涵体中。 四、Western Blotting印迹分析 分别携带质粒pGEX-6p-1/TAG和pGEX-6p-1的E.coli DH5α表达出分子量约69KD的GST-TAG融合蛋白和约26KD的GST蛋白。Western Blotting结果表明这两个蛋白能被Anti-GST-Ab识别,重组TAG蛋白被成功表达。 五、重组TAG蛋白的初步纯化 尿素法纯化重组TAG蛋白显示其最佳洗涤浓度为4M尿素,用8M尿素进行溶解可得较好效果。 结论 本研究以生物信息学为基础设计了肺孢子菌p55蛋白抗原表位的串联基因,成功地建立了表达多表位串联基因的原核表达系统。为进一步研制以该多表位串联基因为基础的疫苗研究奠定了良好的基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 陈兰英,赵桢,王晓涛,屈二军,陈建南;HSP70基因在人胃癌、食道癌及宫颈癌中高表达和癌变关系的研究[J];癌变.畸变.突变;2005年04期

2 王继英;武英;郭建凤;呼红梅;张印;;莱芜黑猪保种群促卵泡素β亚基和雌激素受体基因、基因型变化情况[J];山东农业科学;2007年01期

3 葛宏华,肖亚中,姚建平;人心室肌球蛋白轻链1基因的克隆及其体外的表达与纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);2004年06期

4 王永芬;边传周;;河南省鸡致病性大肠杆菌耐药性质粒的研究[J];安徽农业科学;2006年13期

5 赵为;邓科君;杨足君;周建平;任正隆;;景天科植物基因组DNA的高效提取方法[J];安徽农业科学;2006年22期

6 臧金灿;樊国燕;乔宏兴;丁明星;;RT-PCR技术检测河南省猪瘟病毒的研究[J];安徽农业科学;2006年24期

7 易庆平;罗正荣;张青林;;植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J];安徽农业科学;2007年25期

8 朱建华,叶棋浓,江泽飞,严景华,宋三泰,黄翠芬;利用GST沉淀技术检测蛋白质间的相互作用[J];癌症;2003年07期

9 袁建辉,贺智敏,余艳辉,陈主初;Tet调控的乳腺癌耐受蛋白表达细胞系的建立及功能研究[J];癌症;2004年10期

10 马文敏,姜泊,赖卓胜,王新颖,耿焱,韩宇晶;大肠侧向发育型肿瘤细胞株ADP-核糖基化因子1的表达及其意义[J];癌症;2005年06期

相关会议论文 前10条

1 闫云君;蔡勇;杨江科;;基于易错POR技术的短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)脂肪酶YZO2的定向进化[A];节能环保 和谐发展——2007中国科协年会论文集（一）[C];2007年

2 郭奕斌;陈路明;孟亚仙;王晶晶;杜传书;潘敬新;;一个广东四川家庭的IDS基因新突变[A];第六届全国优生科学大会论文汇编[C];2006年

3 于占东;赵双宜;何启伟;王翠花;牟晋华;刘春香;;抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的研究[A];中国园艺学会第十届会员代表大会暨学术讨论会论文集[C];2005年

4 龚束芳;杨涛;车代弟;;偃麦草根茎非质体蛋白质修饰冰晶能力的观察[A];2007年中国园艺学会观赏园艺专业委员会年会论文集[C];2007年

5 王英;滕齐辉;曹慧;胡锋;崔中利;;淹水和旱作水稻土中细菌群落多样性的空间分布[A];第四次全国土壤生物和生物化学学术研讨会论文集[C];2007年

6 周兴;张居农;;蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK~R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达[A];中国奶牛协会2007年会论文集（上册）[C];2007年

7 崔晓燕;方定志;刘秉文;;人肝脏高凝状态相关基因的筛选[A];2004全国血脂分析及其临床应用学术研讨会、第七届全国脂蛋白学术会议论文汇编[C];2004年

8 王志宇;王健伟;何深一;吴围屏;韩金祥;洪涛;;截短型A组轮状病毒VP6在E.coli中的高效表达[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年

9 张娟;赵利;魏丽;刘建涛;曾志将;;贮藏温度和时间对蜂王浆水溶性蛋白质的影响[A];中国养蜂学会蜜蜂饲养管理专业委员会第十三次学术研讨会论文集[C];2007年

10 雷楗勇;张莲芬;杨健良;金坚;;人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达[A];2006第六届中国药学会学术年会论文集[C];2006年

相关博士学位论文 前10条

1 侯周华;输血传播病毒（TTV）基因变异的临床意义[D];中南大学;2003年

2 赵建国;鸡解偶联蛋白（UCP）基因与生长和体组成性状关系的遗传学研究[D];东北农业大学;2003年

3 张颖;淋巴细胞HIV-1辅受体的表型剔除对病毒感染的阻断作用[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年

4 李琳琳;膳食因素和Calpain-10基因与维吾尔族哈萨克族2型糖尿病[D];新疆医科大学;2003年

5 于红;钝顶螺旋藻多糖抗病毒及抗肿瘤作用的研究[D];中国海洋大学;2003年

6 孙雪;龙须菜cDNA文库构建及EST和ISSR分析[D];中国海洋大学;2003年

7 李永辉;芳香族氨基酸生物合成代谢途径调控研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年

8 赵计林;问号赖型钩端螺旋体毒力新基因的筛选及其功能研究[D];四川大学;2003年

9 汉丽梅;鸡端粒相关序列克隆与定位及MDV特异序列定位MD宿主细胞的研究[D];中国人民解放军军需大学;2003年

10 于录;葡萄球菌多重耐药转运蛋白NorA介导的氟喹诺酮耐药性研究[D];中国人民解放军军需大学;2003年

相关硕士学位论文 前10条

1 朱德林;中国葡萄属野生种抗黑痘病基因RAPD标记作图[D];西北农林科技大学;2004年

2 张征峥;白细胞介素15基因克隆、改型及其在NCI-H446细胞中的表达[D];河北医科大学;2004年

3 巩燕;烟草中乙烯受体NTHK2全长基因的克隆和功能研究[D];山东农业大学;2003年

4 柏亚铎;牛传染性鼻气管炎PCR诊断方法的建立及初步应用[D];吉林农业大学;2002年

5 柏锡;t-PA基因对黄瓜的遗传转化及其在不同植物中的表达效率分析和密码子改造[D];东北农业大学;2003年

6 邹敏芬;黄瓜DNA伏安传感器制备及应用研究[D];湖南大学;2003年

7 胡洋;h-CR1及m-CR1基因在E.coli和Pichia pastoris中的克隆表达及其抗体制备[D];沈阳药科大学;2003年

8 江汕;人细胞增殖相关激酶Plk3/Prk基因的表达及其功能的研究[D];南京医科大学;2003年

9 杨明夏;抗药性相关NYD-Ch和NYD-Tr基因表达与初步鉴定[D];南京医科大学;2003年

10 郑祖宇;E26菌剂对葡萄悬浮细胞防卫反应基因pal和sts表达的影响[D];中国农业大学;2003年

，

本文编号：2292330