结核病新型分子标识的筛选及其在诊断和疫苗中的应用

发布时间：2018-10-24 21:38

【摘要】：结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)及牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, Mbovis)引起的一种慢性消耗性人兽共患病。该病不仅给畜牧业尤其是奶业造成了巨大的经济损失,而且严重威胁人类健康。目前已有证据表明结核病可在人和动物之间相互传播,且大部分带菌个体不发病；而作为目前国际上唯一得到官方认可的用于结核病防治的疫苗卡介苗(BCG),只对儿童能够进行有效的保护,对成人的保护效果极差。这些都给人类结核病的诊断和控制造成了巨大的障碍。目前用于结核病诊断的方法主要有胸部X光透视、细菌培养等检测方法。临床胸透对结核病诊断不具有特异性,细菌检测对生物安全水平要求高,且分菌分离率低,费时费力。分子生物学方法虽有应用,对仪器设备有一定的要求,且假阳性率高。因此,免疫学方法在结核病诊断方面应用的一直受到关注。结核分枝杆菌感染导致的细胞免疫和体液免疫呈分离状态,在感染初期以细胞免疫占优势,体液免疫产生较晚,与病程呈正相关。传统的结核菌素(PPD)皮内变态方法主要是检测细胞免疫阶段的,该方法已沿用百年,是一种敏感的检测方法。但该法特异性较差,不能识别卡介苗免疫与结核分枝杆菌感染；对于免疫低下个体或感染晚期的活动性结核患者的反应可能为阴性。以血液检测为基础的IFN-γ体外释放方法在国外已开始应用,用于检测结核分枝杆菌潜伏感染具有很高的灵敏度与特异性。早期所选用的抗原为PPD,由于PPD检测具有上述缺陷,后期选用了特异性刺激蛋白CFP10/ESAT6国外试剂盒需要对淋巴细胞进行分离,操作复杂；且价格昂贵,检测成本不能为我国国情所接受。为此,本研究建立了IFN-γ体外释放方法用于结核病的诊断。此外,IFN-γ检测法在区分潜伏感染与活动性结核方面灵敏度有待提高,且操作需要细胞培养,相对复杂。为了提高结核病诊断的灵敏度与特异性,本研究进一步开展了结核病新型分子标识的筛选,同时利用已被认识的分子标识,构建了改良BCG,初步研究了改良BCG的免疫效果。论文主要研究内容如下： 1.结核病新型分子标识的筛选利用蛋白芯片技术,用结核分枝杆菌特异蛋白CFP10/ESAT6(后简称CE蛋白)模拟结核菌对全血进行刺激,取上清液进行细胞因子芯片(RayBiotech516点)分析,检测510种细胞因子。经CE蛋白刺激后,有67种细胞因子表达量增高了1.9倍以上,43种下调了至少2.0倍。其中包括炎性因子,免疫调节因子,趋化因子,生长因子,血管原性因子,可溶性受体,粘附因子等。对活动性结核病人、潜伏感染者、肺癌病人和健康对照人的血浆进行了蛋白芯片分析(SpringBio芯片656点),检测651个蛋白,通过比较不同感染状态的血浆蛋白差异表达情况,结果仅在活动性结核病人血浆中表达升高1.9倍以上的蛋白有21种,下调2.0倍以上的蛋白有72种。在上调的蛋白中包括角蛋白,神经丝蛋白,与基因修复相关蛋白,热休克蛋白等。 2.人IFN-γ基因的克隆、测序及蛋白的表达纯化根据GenBank人IFN-γ的基因序列(GenBank Accession No. NM000619)人工合成人IFN-γ基因全序列,并克隆至pET28a载体中,构建了重组表达质粒hIFN-γ-pET28a,并将其转化BL21(DE3)中,经IPTG诱导3h后获得高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在。提取包涵体并纯化至电泳纯。 3. hIFN-γ单克隆抗体及多克隆抗体的研究用重组蛋白hIFN-γ-pET28a作免疫原,制备了能够稳定分泌的杂交瘤细胞和兔高免血清。利用间接ELISA方法对诱生的小鼠腹水及兔高免血清进行效价测定,结果表明单克隆抗体效价大于215,多克隆抗体效价大于212。通过单克隆抗体亚类鉴定结果表明所制备的单克隆抗体类型为IgG1。 4.IFN-γ体外释放方法的建立及其在人结核病检测中的应用利用制备的单克隆抗体及多克隆抗体建立了检测IFN-γ的双抗夹心ELISA方法,引入本实验室串联表达的结核分枝杆菌特异蛋白CFP10/ESAT6,对全血进行刺激,取上清液进行ELISA检测,并通过与阳性对照刺激物和阴性对照刺激物的比较来判定样本是否接触过结核。该方法能够对BCG和结核病感染进行鉴别诊断,并且能够有效检测出潜伏感染个体,且敏感性可达到94.6%(105／111),在284名健康对照人中,检测出阴性结果236个,阴性检出率83.1%(236／284)。 5.结核病重组疫苗的研究对结核分枝杆菌中具有高免疫原性的基因Ag85B、Rv3872、CFP10、ESAT6,进行串联表达,整合至载体pTIC6a中,通过电转化方法将重组质粒转化至BCG和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, M.S.)中获得重组BCG (rBCG)与重组耻垢分枝杆菌(rM.S.)。将重组菌免疫小鼠。检测小鼠血清抗体和脾细胞增殖能力、及免疫后10周脾细胞刺激上清液中IFN-γ和IL-4分泌水平。结果表明免疫后4周起,rBCG组小鼠血清抗体和脾细胞增殖能力明显高于BCG组；免疫10周后rBCG组小鼠IFN-γ分泌量高于BCG组小鼠,且差异显著(P=0.022)。以上结果表明,rBCG能同时诱发更高的细胞与体液免疫反应,具有较好的应用前景。rM.S.疫苗虽然能够在一定程度上激发机体的免疫反应,但免疫反应的强度和持续性不如BCG和rBCG。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】