疲劳型亚健康小鼠模型的创建及维康颗粒对其免疫功能的影响

发布时间：2018-10-26 12:51

【摘要】：[背景] 亚健康状态(sub-health status)是介于健康与疾病之间的一种中间状态,主要表现为活力、反应能力降低,适应能力减退,但无明确的疾病诊断。亚健康的临床表现复杂,涉及到躯体、心理、社会多个方面的内容,其中常见临床表现有疲乏无力、头晕头昏、心悸胸闷、睡眠紊乱、食欲不振、易于感冒、情绪低落、注意力下降、烦躁易怒、人际关系紧张等。流行病学调查结果显示,亚健康人群的现患率在60%-70%,亚健康已严重影响人们的工作能力和生存质量,给人们的健康生活带来极大危害。探讨亚健康的发生机制,有效防治亚健康,成为医学界亟待解决的问题。调查结果显示疲劳是亚健康状态的常见临床表现,疲劳型亚健康是亚健康的主要类型之一,因此研究疲劳型亚健康的发生机制,积极干预疲劳型亚健康,应做为亚健康研究与防治的重中之重。免疫系统是机体重要的防御系统,免疫系统的功能与人类健康息息相关,如炎症,感染,肿瘤,衰老,生殖等人类绝大多数疾病的发病机理都涉及到免疫功能。研究表明疲劳型亚健康发生的相关因素超负荷工作、心理压力过大、熬夜、生活不规律等可以导致机体的免疫功能异常,因此有必要从免疫功能角度探讨疲劳型亚健康的发生与免疫功能的关系。动物模型作为现代生物医学研究中的一个极为重要的实验方法和手段,具有可控性好、结果易获得、容易复制等优点。研究建立理想、公认的疲劳型亚健康动物模型对研究疲劳型亚健康的发生、发展规律及其防治措施的制定有重要意义。本课题组利用强迫负5%体重力竭游泳复合剥夺睡眠20h的方法已制备出疲劳型亚健康的大鼠模型,但该模型仍不是一个理想的疲劳型亚健康模型,需待进一步改进。由于目前亚健康的发生机制仍不清楚,亚健康的治疗也缺乏明确有效的手段。中医学以辨证论治和整体观念为核心思想,在亚健康防治方面有独特优势。临床和动物实验已经表明,维康颗粒在干预疲劳型亚健康方面有确切疗效,但其具体药理机制尚未完全明确。为此,本研究通过模拟疲劳型亚健康形成相关因素制备疲劳型亚健康的小鼠模型,并运用相关免疫技术重点探讨疲劳型亚健康与免疫功能之间的关系及维康颗粒干预对模型小鼠免疫功能的影响。本课题主要分为两个部分：一、疲劳型亚健康小鼠模型的创建。通过强迫小鼠水中站立的造模方式,造成造模小鼠的身心疲劳、心理应激、生物节律紊乱,以模拟疲劳型亚健康的形成因素,并根据小鼠行为学表现、疲劳程度、生化及各器官病理组织切片等指标对疲劳型亚健康小鼠模型进行界定和优效性评价。二、维康颗粒对疲劳型亚健康小鼠免疫功能的影响。观察维康颗粒对疲劳型亚健康的疗效,利用免疫学实验技术分析疲劳型亚健康小鼠以及维康颗粒干预后小鼠的免疫功能变化。 [目的] 建立和评估疲劳型亚健康小鼠模型；从免疫功能角度,初步探讨疲劳型亚健康的发生机制,及维康颗粒干预对模型小鼠免疫功能的影响,为疲劳型亚健康病理机制及维康颗粒对其作用机理的研究奠定基础。 [方法] 第一部分疲劳型亚健康小鼠模型的创建实验一：疲劳型亚健康小鼠模型造模方式研究 SPF级健康雄性KM小鼠40只,随机分为4组：正常对照组、造模6h组、造模8h组、造模10h组,每组10只,5只／盒。模型各组小鼠采用强迫小鼠水中站立的方式制备疲劳型小鼠模型。具体方法：每日上午9：00,将模型各组小鼠放入水深为0.8cm、大小为29cm×18cm×15cm的塑料盒内,并于当天下午15：00(6h组)、17：00(8h组)、19：00(10h组)分别将模型各组小鼠从水盒中拿出,正常饲养；正常对照组：不给予任何刺激,自由饮食。实验共21天,每3天负7%体重力竭游泳一次,记录游泳时间,测定其疲劳程度。(注：本实验以力竭游泳时间评估小鼠疲劳程度。方法：将7%自身重量的铅坠系于小鼠尾部,而后将负重小鼠放入水温25℃的水桶中进行力竭游泳测试,力竭游泳标准为小鼠鼻尖沉入水下10s)。实验过程中观察各组小鼠的精神状态、活动情况、饮食、二便以及爪、鼻唇、耳等色泽等外观行为变化。实验二：疲劳型亚健康小鼠模型造模时间研究 SPF级健康雄性KM小鼠150只,随机分为15组：模型0d游泳组、模型5d力竭游泳组、模型9d力竭游泳组、模型12d力竭游泳组、模型16d力竭游泳组；正常0d力竭游泳组、正常5d力竭游泳组、正常9d力竭游泳组、正常12d力竭游泳组、正常16d力竭游泳组；模型5d生化组、模型9d生化组、模型12d生化组、模型16d生化组和正常生化组。模型组采用实验一中确定的造模强度对模型各组进行造模。在各组小鼠实验造模结束后,力竭游泳组7%负重力竭游泳,测定其疲劳程度；生化组不需力竭游泳,仅眼眶取血检测血生化、血常规,并对各脏器组织做病理切片检查。实验过程中观察各组小鼠的精神状态、活动情况、饮食、二便以及爪、鼻唇、耳等色泽等外观行为变化。实验三：疲劳型亚健康小鼠模型的评价 SPF级健康雄性KM小鼠40只,随机分为4组：正常组、模型组、模型自然恢复7d组、模型自然恢复14d。后三组按照实验一、二的中确立的亚健康造模强度与时间,制备疲劳型亚健康模型。分别于造模结束后第2d、8d、15d对正常组及模型组、模型自然恢复7d、14d组进行7%负重力竭游泳,测定其疲劳及疲劳恢复程度；实验过程中观察各组小鼠的精神状态、活动情况、饮食、二便以及爪、鼻唇、耳等色泽等外观行为变化。第二部分维康颗粒对疲劳型亚健康小鼠免疫功能的影响 SPF级健康雄性KM小鼠120只,随机分为6组：维康颗粒高剂量组、维康颗粒中剂量组、维康颗粒低剂量组、模型组、模型自然恢复组、正常对照组。每组下设为两小组,分别用于力竭游泳及免疫功能检测,每小组小鼠10只。前五组按第一部分实验中确定的亚健康造模方式制备疲劳型亚健康模型后,维康颗粒高剂量组、维康颗粒中剂量组、维康颗粒低剂量组、模型自然恢复组分别给予维康颗粒高、中、低剂量水溶液、生理盐水1ml灌胃,连续7d；正常对照组不作处理,自由饮食。实验过程中观察各组小鼠的精神状态、活动情况、饮食、二便以及爪、鼻唇、耳等色泽等外观行为变化。实验结束后分别检测小鼠的力竭游泳时间和小鼠脾脏及胸腺指数、T、B淋巴细胞增殖反应能力。 [结果] 第一部分疲劳型亚健康小鼠模型的制备实验一：与正常组相比,造模10h组小鼠活动能力、反应能力均有显著下降；8h组活动能力、反应能力随造模时间延长有所下降；6h组活动能力、反应能力变化不明显。随造模天数延长,各造模小鼠力竭游泳时间呈下降趋势,其中造模10h组小鼠游泳时间下降趋势急速,造模第3d,与实验开始前比较即有显著差异(P0.05)。造模6h下降趋势平缓,第12d以后力竭游泳时间始较0d有显著统计学意义(P0.05)。造模8h组,小鼠力竭游泳时间下降速率介于6h、10d之间,实验第3d较实验前有显著差异(P0.05),之后力竭游泳呈平稳下降趋势。正常对照组,小鼠力竭游泳时间变化不明显。造模强度和造模天数的交互效应显著(F=43.021,P=0.000)。实验二：与正常组比较,造模9d组,全身皮毛有浸湿现象,皮毛灰暗欠光泽,遗留水盒污渍,逃避反应降低,小鼠体重下降不明显；模型5d、9d、12d、16d组与正常各时间组比较,游泳时间显著下降,P=0.000。血生化示,造模各组小鼠在BUN、ALT、AST、TG水平上存在差异,且其升高或降低幅度与造模天数有关,按其变化幅度从大到小排序,依次为模型16d、12d组、9d组、5d组。其中模型16d组BUN、ALT、AST水平显著升高,TG显著降低,与正常组比较统计学意义(P0.05)；模型12d、9d、5d组各项血生化改变在正常范围内,与正常组比较无统计学差异。其中模型12d组指标变化幅度仅次于16d组,与正常组比较有潜在差异性趋向；模型5d组各指标变化最不明显,与正常组水平相近；模型9d组指标变化介于12d与5d之间,BUN、ALT、AST、TG在正常范围内轻度升高或降低。各组血常规及病理切片结果示未见明显异常。实验三：根据实验一、二的实验结果,采用强迫小鼠每天水中站立8h,连续9d的造模方式,制备的小鼠的疲劳型亚健康模型,其力竭游泳时间明显下降,小鼠明显疲劳；去除造模因素,休息恢复7d后疲劳程度虽有所减轻,但与正常组比较,仍未恢复到正常程度(与正常组比较,P0.05),至恢复14d后,小鼠力竭游泳时间与正常组比较无显著性差异(P0.05)。第二部分维康颗粒对疲劳型亚健康小鼠免疫功能的影响与模型组比较,维康颗粒各干预组及模型自然恢复组,力竭游泳时间显著增加(P0.05),且维康颗粒各干预组力竭游泳时间高于模型自然恢复组(P0.05),其中维康颗粒高、中剂量组力竭游泳时间恢复最高,与正常组比较无显著性差异(P0.05)。模型组胸腺指数及脾脏指数较正常组明显减小(P0.05),经维康颗粒干预及自然恢复后小鼠胸腺指数及脾脏指数有恢复趋势,其中维康颗粒高剂量组恢复水平最高,维康颗粒高、中剂量组与正常组比较无显著性差异(P0.05)。T、B淋巴细胞增殖反应结果显示,模型组T、B淋巴细胞经ConA/LPS刺激后刺激指数明显降低(与正常组比较,P0.05)；经维康颗粒干预或自然恢复后的小鼠OD值及刺激指数有增加趋势,其中维康颗粒高剂量组最为显著,基本恢复到正常水平,其OD值及刺激指数与正常组无明显差异(P0.05)。 [结论] 一、本研究最终确立采用强迫小鼠水站立8h,连续9d,以模拟过劳、心理应激、生物节律紊乱等疲劳型亚健康形成相关因素的造模方式,可成功制备疲劳型亚健康小鼠模型；模型评价表明该模型的稳定性、重复性较好。这为疲劳型亚健康病理机制的研究及相关药物的筛选提供了技术平台。二、疲劳型亚健康状态下小鼠存在免疫功能紊乱的情况,疲劳型亚健康的发生可能与免疫功能异常存在一定的联系。三、疲劳型亚健康状态小鼠在去除造模因素14d后,可恢复至正常状态,提示疲劳型亚健康状态可以向正常状态转化。四、维康颗粒干预疲劳型亚健康的效果优于自然恢复组。维康颗粒可明显缓解模型小鼠疲劳,延长其力竭游泳时间,缩短模型小鼠向正常状态恢复的时间。此外,维康颗粒还可调节疲劳型亚健康小鼠的免疫功能状态,促进其向正常状态转变,这可能是维康颗粒发挥纠正疲劳型亚健康状态的作用机制之一。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R285.5;R-332

【参考文献】