Zta抑制MHC Ⅱ分子表达的分子机制及Zta相互作用蛋白的初步研究

发布时间：2018-10-26 13:35

【摘要】： 自十九世纪末发现烟草花叶病毒以来,大量的病毒学研究证实,许多病毒与宿主在相互制约、相互抗衡中维系一种微生态平衡。一方面,机体免疫系统为防御病原微生物的侵袭,在进化过程中建立了高度复杂、精细的抗感染免疫机制;另一方面,病原微生物也在进化过程中获得了各种各样的免疫逃逸机制。例如,病毒可直接抑制宿主的免疫系统、通过抗原漂移乃至抗原转换等机制避免宿主免疫系统的识别和攻击。近年来,MHC II分子介导的免疫识别在抗病毒免疫中的积极作用逐渐得到重视。MHC II分子的细胞分布较为狭窄,一般仅在抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)中高表达,主要包括巨噬细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞和B细胞。MHC II分子的表达具有重要的生理意义,其表达上调可增加APC将抗原肽呈递至CD4+T细胞的机会,从而增强机体特异性免疫应答的水平。已证实人类免疫缺陷病毒HIV-1、人类单纯疱疹病毒HSV-1等均可通过影响MHC II分子依赖的免疫识别、逃避宿主免疫系统的攻击。 EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)是在人群中造成最广泛感染的病毒种类之一。研究表明,90~95%以上的不同人种均有EBV感染史。大量的临床研究表明,EBV与多种恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等的发生发展密切相关。此外,EBV感染带来的严重问题尚包括移植后淋巴增殖性疾病(post-transplant lymphoproliferative disease, PTLD)。 EBV主要感染人B细胞和上皮细胞。EBV在宿主细胞中以两种形式存在:潜伏期和裂解期,前者不表达或仅表达少数几种病毒蛋白;后者可表达近百种病毒蛋白。Zta是EBV的立早基因bzlf1的表达产物,作为碱性亮氨酸拉链(basic-leucine zipper, bZIP)转录因子家族的成员之一,在EBV的生活周期中发挥重要的作用。Zta是EBV活化时表达的第一个病毒蛋白,能诱导宿主细胞中处于潜伏期的EBV进入裂解期,引发病毒大量复制并造成病毒播散。宿主细胞中处于绝对潜伏期的EBV不表达任何病毒蛋白,此时无法鉴别携带EBV的细胞与正常细胞。目前认为,清除进入裂解期的EBV是控制EBV感染的关键。由于Zta蛋白是EBV进入裂解期的关键分子和标志物,因此Zta一直是EBV研究的重要靶分子。 MHC II分子限制性的CD4+ T细胞介导的免疫应答在机体控制疱疹病毒感染的过程中发挥重要的作用。前期研究发现,EBV进入裂解期后,宿主细胞中MHC II分子的表达显著下调。值得注意的是,疱疹病毒颗粒在宿主细胞内体中装配,而内体恰为MHC II分子与抗原肽结合的部位。由于B细胞既是EBV的主要宿主细胞之一,又是MHC II类限制性免疫应答的抗原呈递细胞(antigen presenting cell, APC),我们推测EBV在进入裂解期时有可能影响B细胞MHC II分子表达、干扰病毒抗原提呈。因此,本研究旨在探索EBV抑制宿主细胞MHC II分子表达的机制。我们利用B淋巴瘤细胞系Raji细胞作为本研究的主要模型细胞,应用TPA/NaB诱导Raji细胞中的EBV进入裂解期,观察到MHC II基因表达下调发生于转录水平,且与Zta的表达相关。进一步研究发现,Zta表达导致MHC-II基因反式作用子(class II transactivator,CIITA)基因转录及蛋白表达受到抑制。我们通过生物信息学分析,在CIITA启动子区发现2个未被报道的潜在的Zta结合位点(Zta response element, ZRE)。随后通过启动子双荧光素酶报告载体实验、染色质免疫沉淀实验和寡核苷酸沉降实验,证实Zta可与CIITA基因启动子近端的ZRE221结合,从而抑制CIITA转录。对ZRE221进行定点突变及应用特异性siRNA抑制Zta表达可逆转Zta对CIITA以及MHC II分子表达的抑制作用,从而揭示了B细胞内裂解期EBV干扰MHC II分子限制性抗原提呈、逃逸宿主免疫清除的一个新的重要机制。 Zta除通过其转录激活结构域参与调节宿主蛋白的转录表达外,还可通过其螺旋化螺旋结构域(coiled-coil domain)与宿主蛋白发生直接的相互作用,进而影响宿主蛋白的功能。已发现Zta可直接与宿主来源的蛋白如维甲酸受体、TATA结合蛋白、p53等发生相互作用,干扰这些蛋白在宿主细胞中执行正常的功能。本研究的第二部分应用免疫共沉淀及蛋白质组学分析,寻找宿主细胞中能与Zta发生相互作用的蛋白,旨在揭示EBV—宿主相互作用、进一步阐明EBV致病的分子机制,为抗病毒治疗策略提供新的信息。我们构建了GST-Zta融合蛋白,通过GST沉降及质谱分析,从宿主细胞中筛选到27种可能与Zta发生相互作用的蛋白,并利用Western blot对其中1种蛋白(CENP-E)进行了验证,证实Zta与CENP-E在体外存在直接的相互作用。研究已发现,CENP-E在细胞周期中可能参与纺锤体检查点的控制,干扰CENP-E的表达可影响姐妹染色体在赤道板的排列,使细胞分裂阻滞于M期,或导致非整倍体子代细胞形成。鉴于CENP-E在细胞周期中的作用,我们对TPA/NaB诱导前后的Raji细胞进行了细胞周期分析,发现诱导后的Raji细胞G2/M期群体比例从14.2%增至44.6%,提示诱导Raji细胞进入EBV裂解期后引起的细胞周期阻滞可能与Zta影响CENP-E在细胞分裂中的功能有关。综上所述,本研究发现:(1)EBV进入裂解期时,Zta蛋白特异性地抑制CIITA及MHC II分子表达。(2)III型CIITA基因启动子区存在一个功能性的ZRE(ZRE221),Zta可结合于ZRE221而抑制CIITA转录,此反式抑制作用依赖于Zta的DNA结合结构域。(3)从诱导的Raji细胞和过表达Zta的Hela细胞中筛选到27种可能与Zta发生直接相互作用的蛋白,证实其中1种蛋白(CENP-E)可与Zta结合。(4)诱导Raji细胞中EBV进入裂解期,可导致细胞周期阻滞于G2/M期,此效应可能与CENP-E/Zta的相互作用有关。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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