肠道病毒71型-C4VP1基因原核表达及免疫原性研究

发布时间：2018-11-03 11:15

【摘要】：目的：肠道病毒71型(enterovirus type 71, EV71)是人类手足口病的主要病原体。此外,还能引起无菌性脑膜炎,脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病。迄今尚无有效的防治手段。VP1蛋白是EV71的主要衣壳蛋白,是病毒主要的中和抗原,它决定病毒的免疫原性。VPl基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性。不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据,而且可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。研究表明,蛋白质有很强的免疫原性,免疫动物可诱导产生高效价的抗体。通过提取病原体中具有免疫保护作用的蛋白,或利用DNA重组技术使重组体表达这类蛋白、多肽或合成肽制成的疫苗,称为亚单位疫苗。亚单位疫苗不含有感染性组分,无须灭活,也无致病性。自1981年成功地将口蹄疫病毒的VP3基因克隆到大肠埃希菌内并制成用于牛和猪的疫苗之后,迄今已研制出包括乙型肝炎疫苗在内的许多亚单位疫苗用于传染病的预防。EV71感染患者的治疗主要以对症治疗为主,缺乏特异、高效的抗病毒药物。、目前,尚无公认的十分有效的预防疫苗。VPl蛋白是EV71的主要中和抗原,是疫苗研究的首选成分。本研究用原核表达系统中表达的EV71 VP1蛋白,免疫家兔,观察免疫效果。方法：1.从河北省疾病控制中心病毒病防治所提供的EV71C4亚基因型病毒临床分离株提取核酸,用VP1基因的特异性引物进行RT-PCR扩增,将扩增产物与pGEM-T载体连接,构建成重组质粒pGEM-T/VP1,转化入DH5α大肠杆菌扩增,提取质粒进行酶切鉴定和测序筛选重组子。2.经酶切鉴定和测序确认后,取双酶切的VP1片段和经过同样两种酶酶切的原核表达载体pET-his连接,构建原核表达质粒pET-his/VP1。3.将原核表达质粒pET-his/VP1转入表达宿主菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达携带有6×HIS标签的VP1蛋白,分别利用HIS单抗和EV71多抗经Western-blot鉴定无误后对目的蛋白进行优化表达。将大量诱导表达后的菌体在冰浴中超声破碎,分离上清和包涵体沉淀,对该蛋白的水溶性进行分析。将包涵体溶液进行SDS-PAGE,切下目的条带,透析袋中透析。定量所得纯化后的蛋白。4.动物实验：选取重约2kg健康新西兰白兔3只,用VP1蛋白背部皮下多点注射免疫,即于脊柱两侧选4～6点,共免疫3次,每次间隔2周。初次免疫每只注射剂量为600μg,加完全弗氏佐剂。加强免疫每只剂量为300μg,用不完全弗氏佐剂。末次免疫后15天,耳缘静脉取血,分离血清,用肠道病毒71型抗体IgG诊断试剂盒(酶联免疫法)检测血清抗体滴度。结果：1.用RT-PCR方法从EV71提取的核酸中扩增出VP1基因片段,并构建了重组质粒pGEM-T/VP1,采用双酶切和DNA测序证实此基因片段与报道的基因序列一致。2.成功构建了原核表达质粒pET-his/VP1,双酶切结果证实插入和连接均正确。3.在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中成功表达了EV71 VP1蛋白,表达蛋白主要以包涵体形式存在。Western-blot证实表达的蛋白可与HIS单抗和EV71多抗产生特异性反应。4.用VP1蛋白免疫家兔,免疫3次后,用肠道病毒71型抗体IgG诊断试剂盒(酶联免疫法),检测血清的抗体滴度,3只家兔血清抗体滴度分别为：1：81920：1：40960：1：40960。结论：1.成功构建了EV71VP1基因原核表达质粒pET-his/VP1。2.在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS成功表达了EV71VP1蛋白并进行初步纯化。3.用纯化的EV71 VP1蛋白免疫家兔能诱导产生特异性抗体。
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【学位授予单位】：大理学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R373

【参考文献】