中国结核分枝杆菌标准化MLVA分型技术及MLST分型的研究

发布时间：2018-11-03 14:19

【摘要】：结核病分子流行病学研究在探索结核病感染传播机制和流行规律等方面具有非常重要的作用,分子流行病学研究的核心技术是分子分型技术。IS6110限制性片段长度多态性(IS6110restriction fragment length polymorphism, IS6110-RFLP)、间隔寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing, Spoligotyping)及多位点可变数目重复单元分析[Multiple Loci VNTR (variable number tandem repeats) Analysis, MLVA]三种方法是目前结核病分子流行病学研究实际工作中最经常使用的方法,被广泛研究和应用,在结核病的病原学、流行病学、感染发病机制等诸多方面的研究中发挥了重要作用。 首先为研究建立适合于中国结核分枝杆菌分子分型和分子流行病学监测的标准化的MLVA技术,本研究通过对128株结核分枝杆菌的46个VNTR位点的分析,首先考虑位点的PCR方法可操作性、及PCR结果的判读等方面因素,根据各个位点的PCR结果图片首先排除掉Qub11b等13个0结果比较多的位点和Rv1895等3个PCR结果条带复杂不易辨识的位点；然后根据分辨率高低及合并位点分辨率,初步确定了16个位点(Mtub21、MIRU26、Qub26、Qub11-a、 ETRE、Mtub04、MIRU10、MIRU16、MIRU40、Mtub30、ETRA、MIRU39、 Mtub38、Mtub39、ETR-F、ETRD)作为标准操作方案选用的位点。 通过计算Hunter-Gaston指数,对国际上比较常用的几种位点组合如12个MIRU位点(Oldl2),12个MIRU位点加3个ETR位点(Old12+ETR),和2006年Supply等研究的15个位点及24个位点组合,同本研究提出的16个位点组合的分型分辨率进行比较。结果Supply提出的24个位点及本研究确定的16个位点的分辨率为最高,达到0.999,Supply提出的15个位点组合的分辨率为0.998,近似于24及16位点,而O1d12位点及Old12+ETR位点组合的分辨率比较低。 而后应用本研究确定的16个位点组合的MLVA方法,以及参考文献发表的IS6110-RFLP、Spoligotyping分型方法标准操作,对我国126株结核分枝杆菌临床分离株及H37Rv和BCG标准菌株,共128株进行分型研究。了解三种分型方法对中国部分地区菌株分型能力,以及对在中国占绝大多数的菌株类型----北京家族菌株中的分型能力做进一步研究。 16位点MLVA方法将128株结核分枝杆菌分成11个簇。共有120个基因型,其中115个独特型,计算的HGI为0.999(可信区间0.998-0.999)；102株北京家族菌株分成94个基因型,独特型89个。将MLVA结果数据提交至MIRU-VNTRplus(http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/aboutus.faces)网站,同其他国家菌株结果相比较,我国的126株菌株MLVA结果具有一定的聚集性,同其他国家菌株结果有明显的区别,绝大多数菌株形成一簇,同菌株库中北京家族菌株分在一起,其他一些菌株呈散在分布。 通过计算分辨率指数,16个位点的MLVA分型分辨率仅次于IS6110-RFLP,而Spoligotyping分型的分辨率比较低,并且MLVA分型同IS6110-RFLP的符合度达到91.1%。考虑到IS6110-RFLP操作困难结果不易判定等缺点,16个位点的MLVA分型在分辨率上近似IS6110-RFLP,完全可以作为一线分型方法,在中国结核分枝杆菌分子分型研究中使用。 本研究还发现1株西藏CAS家族菌株,和两株Spoligotyping结果近似的新疆菌株,3株菌株的MLVA结果也比较相似,都分在MG9一簇,但IS6110-RFLP结果相距比较远,3株菌还存在比较大的差异,这2株新疆菌株是否能划分为CAS家族还需要进一步的研究。由于CAS家族菌株通常分布于印度等地区,分析这1株西藏CAS菌株可能是由旅游者携带入境。 单核苷酸多态性(single nucleotide polymophism, SNP)是非常有用的遗传标识,以此为基础的多位点序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)分析也成为近年发展起来的新型分型方法。MLST是基于病原微生物管家基因位点上的单核苷酸变异(多态性)建立的分型方法。目前已经有MLST分析网站(www.mist.net和http://pubmlst.org),收录了许多病原体资料,已建立了脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、空肠弯曲菌、幽门螺杆菌等18种原核生物及白色念珠菌等真核生物的MLST库,但是尚没有结核分枝杆菌MLST数据库。 本研究用中国疾病预防控制中心传染病所结核室CCDC05079及CCDC05180两株已经完成全基因组测序的菌株序列,以及NCBI发布的H37Rv全基因序列,经三株菌株全基因比对,选择有差异的管家基因,进行MLST分型研究,计算分辨率指数,选择分辨率最高的7个管家基因(rmlC、mpt53、panD、 gcvH、recX、mprA和ideR)作为此次MLST分型的数据基础。49株结核分枝杆菌的7个管家基因测序结果用MEGA4软件进行分型研究,用NJ方法绘制的菌株进化关系图,由rmlC基因片段上两个SNP(rmlC101G→C、rmlC345A→C)变异将49株菌株分成两个部分,并且这两个SNP都引起氨基酸的变异(RmlC34G→A、 RmlC115E→D)。rmlC基因编码RmlC (dTDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖3,5表异构酶),参与dTDP-鼠李糖代谢,而L-鼠李糖是维持分枝杆菌细胞壁完整性,参与分枝杆菌生长的重要物质,参与其代谢的任何一种酶都对分枝杆菌生长至关重要,而两簇菌株在rmlC基因片段上的区别提示两簇菌株潜在的生长情况差异。 MLST引入的基因片段还包括panD、ideR、mprA等毒力相关的基因片段。MLST分型引入毒力相关基因能够将菌株分型资料与毒力因素相联系,不但在研究疾病的流行传播情况及追溯传染源的方面具有良好的应用前景,而且在结核分枝杆菌型别与致病力联系方面的研究也具有重要的意义。 另外,比对多个基因片段的核酸序列,并将每一组不同的等位基因的排列组合作为一个基因型,即一个序列型(Sequence-typying, STs)。这些以等位基因STs编号为基本分析单位,通过相关序列的运算法则BURST(Based upon related sequence types)分析与其有亲缘关系的基因类型,将49菌株一共分成40个STs,以ST9和ST2为中心的克隆群是菌株数量最多的,共有菌株20株,是主要的流行克隆群。49株菌株的7个管家基因片段一共有62个SNP位点,成为建立MLST数据库的基础。
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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378.911

【参考文献】

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本文编号：2308040