IL-2和IL-15对脐血天然免疫细胞分化的不同效应及其机制

发布时间：2018-11-03 21:28

【摘要】： 天然免疫系统是机体抵御外来微生物抗原入侵的第一道防线。自然杀伤细胞(NK细胞)是天然免疫系统的重要组成部分,是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要的免疫调节细胞。NK细胞不表达典型的抗原识别受体,不需预先活化就能够识别并杀伤异常细胞,并迅速分泌可溶性因子包括趋化因子和细胞因子,在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节和造血调控等方面发挥重要作用。NKT细胞也是机体天然免疫系统的重要的细胞群体,它既表达特异性的T细胞的标志,又表达NK细胞的标志,通过分泌细胞因子和杀伤功能在对感染、肿瘤、移植、自身免疫性疾病、炎症等的免疫应答中发挥重要作用。 IL-2与IL-15是γc家族细胞因子的成员,它们是重要的细胞生长因子,能够调控淋巴细胞的增殖、活化和生存。虽然IL-2和IL-15受体含有相同的β和γ亚单位,能够活化下游共同的JAK-STAT等信号通路,但是在许多适应性免疫应答中,IL-2和IL-15表现出了不同的甚至相反的功能。脐血中含有大量未成熟的细胞和造血前体细胞,具有分化潜能,研究这些细胞在IL-2和IL-15作用下的发育分化情况,将有利于发现些许天然免疫细胞发育分化的线索,以及IL-2和IL-15在其中的不同作用,为以脐血天然免疫细胞为基础的生物治疗提供理论依据。 NK92细胞是一种自然杀伤细胞系,具有与人活化的NK细胞相似的表型特征和功能特点,是研究NK细胞功能的很好的工具。NK92细胞无需抗原预先作用,就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞,可在体外长期培养大量扩增,具有广谱抗肿瘤作用,使其成为一种有效的免疫治疗剂。我们对NK92细胞杀伤靶细胞的可能的杀伤机制进行了探索,以期为有效的NK细胞治疗的提供线索。 本实验中,我们分离脐血单个核细胞,分别加入IL-2和IL-15进行培养,采用流式细胞术检测细胞的表型以及各细胞群体的比例,结合细胞计数推算各细胞群体的细胞数量;利用ELISA方法和胞内细胞因子染色技术,检测特定细胞细胞因子的分泌情况;利用Annexin V染色和胞内Bcl-2和Bcl-xL染色,分析细胞亚群的凋亡情况;利用MACS和FACS纯化细胞,检测特定纯化细胞在不同刺激因素作用下的变化情况;利用~(51)Cr释放法检测细胞对K562细胞的杀伤活性;利用流式细胞术检测细胞与细胞的结合和细胞内信号通路的活化;利用激光共聚焦显微镜技术和荧光抗体,观察细胞-细胞之间的免疫突触,相关分子在细胞表面分布的情况以及信号分子的活化。通过上述研究方法,我们初步获得了以下结果以及结论: 1.脐血NK细胞活性低与其高表达NKG2A/CD94和低表达颗粒酶B有关 首先我们对脐血NK细胞的比例和杀伤功能的检测发现,尽管脐血NK细胞和CD8~+ NK细胞的比例都高于外周血,但是脐血NK细胞的杀伤功能却显著低于外周血NK细胞。分析NK细胞受体的表达发现,活化性NK细胞受体CD16,NKG2D和NKp46的表达在脐血和外周血NK细胞没有差异,但是抑制性NKG2A/CD94受体的表达在脐血NK细胞明显增高。对于杀伤效应分子的检测发现,颗粒酶B在脐血NK细胞的表达明显低于外周血NK细胞,而细胞内穿孔素,IFN-γ,TNF-α的表达,以及膜表面FasL和TRAIL的表达在脐血和外周血NK细胞没有明显差异。 综上所述,抑制性NKG2A/CD94受体的高表达和颗粒酶B的低表达与脐血NK细胞活性低有关系。 2.IL-15抗脐血CD56~(dim)细胞凋亡的作用与Bcl-xL有关 比较分析IL-2和IL-15对脐血NK细胞的作用发现,IL-15能够促进CD56~(bright)NK细胞和CD56~(dim)NK细胞的增殖,而IL-2只能维持CD56~(bright)NK细胞的生存。IL-15培养的NK细胞凋亡的比例明显低于IL-2,凋亡细胞大都为CD56~(dim)NK细胞,而且抗IL-2的中和抗体能够协同IL-15减少NK细胞的凋亡。应用纯化的CD56~(dim)NK细胞做进一步研究得到同样的结果。对抗凋亡蛋白的检测发现,Bcl-2的表达在IL-2和IL-15培养的CD56~(brigh)NK细胞和CD56~(dim)NK细胞中没有明显差异;与IL-2相比,IL-15培养的NK细胞表达高水平的Bcl-xL,而目CD56~(bright)NK细胞Bcl-xL的表达高于CD56~(dim)NK细胞。这提示,Bcl-xL在IL-15抗NK细胞凋亡中起重要作用。此外,对IL-2Rα和IL-15Rα的检测发现,IL-15能够显著上调NK细胞IL-2Rα的表达并能更好的维持IL-15Rα的表达。 综上所述,IL-2促进CD56~(dim)NK细胞凋亡而IL-15能够抑制其捌亡,IL-15的抗凋亡作用与Bcl-xL的高表达相关。因此IL-15在维持CD56~(dim)NK细胞的长期的功能中起重要作用。 3.IL-2和IL-15对脐血NKT样细胞的发育和活化产生不同的作用 利用体外长期脐血单个核细胞培养发现,CD3~+CD56~+ NKT样细胞由CD34~-CD56~-细胞发育而来,CD34~+细胞和CD56~+细胞在IL-2或者IL-15的作用下只能产生极少量的NKT样细胞。IL-2促进NKT样细胞增殖的能力高于IL-15;但是IL-15培养的NKT样细胞的活化程度(表达高水平的活化标志CD161,CD25和IFN-γ)高于IL-2组而凋亡比例低于IL-2组。对Bcl-xL的检测发现,IL-15培养的NKT样细胞Bcl-xL的表达高于IL-2组。 综上所述,IL-2能够促进NKT样细胞增殖,但是IL-15可以更有效的活化NKT样细胞,并使其维持更高的活性。IL-15的这些作用可能与其在GVHD中的致病作用有关系。 4.ERK1/2通路在以CD11a和CD2为基础的NK92细胞的杀伤中起重要作用 首先利用流式细胞术能够检测到NK92细胞与靶细胞的结合,而且NK92细胞的杀伤活性与效靶细胞结合的比例有关,结合率越高,杀伤功能越强。许多因素都能影响NK92与靶细胞的结合,如抑制性NK受体的表达,细胞膜流动性的破坏,EDTA等。对细胞粘附分子的研究发现,CD11a和CD2在NK92细胞和K562细胞相互作用的界面上有聚集现象,提示二者可能在NK92细胞结合K562细胞过程中起重要作用。K562细胞与NK92细胞的相互作用能够活化NK92细胞的ERK1/2通路,抑制ERK1/2的磷酸化显著降低NK92细胞的杀伤功能。 综上所述,NK92细胞结合靶细胞是其行使杀伤功能的先决条件。效靶结合活化NK细胞的ERK1/2信号通路也在NK92细胞杀伤靶细胞中起重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

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本文编号：2309091