Aβ寡聚体单克隆抗体的制备及功能研究

发布时间：2018-11-06 12:26

【摘要】： 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种常见的渐进性神经退行性疾病。其典型的病理特征为大脑皮层及海马区的β淀粉样肽(Amyloidβ-peptide,Aβ)在胞外积累并形成老年斑(senile plaque,SP)、脑神经细胞内tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)以及神经元突触功能异常及锥体神经细胞丢失。目前认为Aβ是导致神经元损伤及认知功能障碍的主要致病物质。研究表明,针对Aβ的主动免疫和被动免疫疗法可以减少转基因AD模型小鼠脑内聚集的Aβ纤维,并且能够明显改善模型小鼠的认知能力。本课题主要进行了Aβ_(1-42)寡聚体单克隆抗体(McAb,以下简称单抗)的制备、鉴定以及其体内、外功能研究。一Aβ寡聚体单抗的制备及性质鉴定在体外将化学合成的Aβ_(1-42)聚合成Aβ寡聚体,用Aβ寡聚体免疫小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过有限稀释法克隆和间接ELISA筛选,获得稳定分泌Aβ寡聚体单抗的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水,采用A蛋白亲和层析从腹水中纯化制备Aβ单抗。并通过SDS-PAGE检测纯化后抗体的纯度,Western Blot检测单抗对Aβ寡聚体的识别,竞争ELISA测定单抗的抗原识别表位与亲和常数。结果显示:获得一株稳定分泌Aβ寡聚体单抗的杂交瘤细胞株(A8),纯化后单抗A8的纯度达到95%以上。A8对16.5-25 KD的Aβ寡聚体有较高的亲和力,为IgG3亚类,抗原识别表位位于Aβ分子N端的1-6位氨基酸,亲和常数为7.89×10~(-8)。二A8单抗的体外及体内生物学活性研究为了解单抗A8对Aβ寡聚体诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用,以Aβ寡聚体诱导SH-SY5Y细胞损伤,用CCK8检测细胞活性。结果显示:1μmol/L单抗A8可显著降低20μmol/L Aβ寡聚体对细胞的毒性作用(p＜0.05)。所以单抗A8可以在体外抑制Aβ寡聚体对SH-SY5Y细胞的毒性。随后我们利用SAMP8模型小鼠,对单抗A8的治疗作用进行了探讨,取8周龄SAMP8小鼠腹腔注射A8(500μg/只),治疗结束后进行Morris水迷宫行为学实验,之后处死小鼠取脑,做石蜡切片免疫组化分析,并对鼠脑全蛋白做WesternBlot检测。结果显示,治疗组小鼠行为学有一定改善,大脑中的Aβ水平及磷酸化tau蛋白降低(p＜0.05),tau蛋白没有变化。三A8单抗轻链重链可变区基因的克隆与分析人源化改造是鼠源单抗用于人体的重要基础,为此我们采用5′RACE法扩增与克隆了A8单抗的轻链、重链可变区基因,并克隆入pMD18-T载体中。测序结果显示重链可变区基因序列全长450 bp,编码150个氨基酸;轻链可变区基因序列全长429 bp,编码143个氨基酸。在GeneBank对氨基酸序列进行比对分析,二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。总之,我们成功制备并获得了Aβ寡聚体单抗A8,该抗体对Aβ寡聚体有较高的亲和力,为IgG3亚类,抗原识别表位位于Aβ分子N端的1-6位氨基酸,亲和常数为7.89×10~(-8)。体外实验表明该抗体可抑制Aβ寡聚体对SH-SY5Y细胞的毒性,SAMP8 AD模型小鼠治疗实验显示,A8抗体可降低小鼠大脑中的Aβ水平及磷酸化tau蛋白,能够改善SAMP8 AD模型认知记忆功能。同时我们还克隆了该抗体的可变区基因,并得到了可变区序列信息。这些工作为进一步开展A8转基因小鼠的治疗性研究、人源化改造及AD诊断研究奠定了基础。
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【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R749.1;R392

【引证文献】