卡介苗（BCG）对人NK细胞功能的调节作用及其机制的研究

发布时间：2018-11-06 14:55

【摘要】： 目的卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)是一种活的减毒牛型结核分支杆菌疫苗,除应用于结核病的预防接种外,还可以作为一种非特异性及特异性的细胞免疫增强剂应用于肿瘤的治疗,并且取得了公认的显著疗效,但是其抗肿瘤的确切机制并不完全清楚。迄今为止,国内外文献报道主要集中在对BCG本身及其作用于T淋巴细胞、抗原提呈细胞和肿瘤细胞等的研究,而BCG对自然杀伤细胞(nature killer cell,NK)的作用仍不清楚。NK细胞是固有免疫的重要组成成分,能够杀伤病毒感染的细胞和肿瘤细胞,并且具有免疫调节功能。本课题拟研究BCG对人NK细胞功能的调节作用及其机制,为探讨BCG抗肿瘤机制提供理论和实验依据。研究对象和方法 1.研究对象:志愿者43例,其中男23例,女20例,年龄范围21-43岁,平均年龄30.3岁,均为抗结核抗体阴性。本课题已取得所有志愿者知情同意,并签署正式的知情同意书。 2.方法:无菌抽取外周静脉血10-20mL,肝素(15 ~ 25U/mL血)抗凝。用Ficoll进行密度梯度离心,获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)。 2.1将PBMC不加或加BCG培养,利用ELISA方法检测培养上清液IFN-γ、TNF-α含量;利用ELISpot方法在单个细胞水平上检测IFN-γ、颗粒酶B产生细胞的频率;以K562为靶细胞,利用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定PBMC杀伤功能。 2.2利用免疫磁珠法纯化NK细胞。将PBMC和NK细胞不加或加BCG、IL-12、PMA+Ionomycin培养,利用ELISA方法检测培养上清液IFN-γ、TNF-α含量;以K562为靶细胞,利用MTT法测定NK细胞杀伤功能。 2.3将PBMC不加或加不同浓度BCG培养,利用ELISA方法检测培养上清液IL-12p40含量;利用流式细胞术检测NK细胞IL-12Rβ1的表达。观察抗IL-12受体β1 mAb(2B10)对BCG作用于PBMC产生IFN-γ及分泌颗粒酶B的影响。 3.统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行独立样本t检验分析,显著性检验标准为P0.05。结果 1.BCG呈剂量依赖的方式诱导PBMC产生IFN-γ和TNF-α。 2.BCG刺激条件下PBMC颗粒酶B分泌细胞数明显高于不加任何刺激剂组(P0.05)。BCG增强正常人PBMC杀伤K562细胞的活性,并且随着效靶比的增高而增强。BCG浓度为0.2μg/ml时即可促进PBMC的杀伤功能,2μg/ml时作用最显著,20μg/ml时促进作用下降。 3.BCG不能诱导纯化NK细胞产生IFN-γ,但与IL-12同时刺激则表现出协同作用。纯化NK细胞在不加任何刺激剂及BCG、IL-12和BCG+IL-12分别刺激等四种条件下均不产生TNF-α。 4.纯化NK细胞经BCG刺激后杀伤K562的活性略高于未刺激的NK细胞,但差异无统计学意义(P0.05)。 5.BCG呈剂量依赖方式诱导PBMC产生IL-12、并促进NK细胞不同亚群表达IL-12Rβ1。 6.在BCG中加入抗IL-12受体β1 mAb(2B10)后,PBMC分泌IFN-γ明显低于单独BCG刺激组(P 0.001),但仍高于不加任何刺激剂组(P 0.01);PBMC分泌颗粒酶B细胞数明显减少(与单独BCG刺激组相比,P 0.05)。结论 1. BCG诱导抗结核抗体阴性正常人PBMC产生IFN-γ和TNF-α。当BCG和IL-12共同刺激时表现为协同作用。BCG促进正常人PBMC颗粒酶B分泌细胞数增加,增强PBMC杀伤K562细胞的活性。 2. BCG单独刺激不能诱导正常人纯化NK细胞产生IFN-γ和TNF-α,但能显著增加IL-12诱导NK细胞产生IFN-γ。BCG不能增强纯化NK细胞杀伤K562的活性。 3.对BCG作用于正常人NK细胞机制的研究表明,BCG可以诱导PBMC产生IL-12,上调NK细胞表达IL-12Rβ1。抗IL-12受体β1 mAb(2B10)能部分抑制BCG对PBMC产生IFN-γ的诱导作用;完全抑制BCG活化正常人PBMC分泌颗粒酶B。因此,我们的研究结果表明BCG间接地促进NK细胞的生物学活性,其机制是通过诱导单核细胞产生内源性IL-12、并上调NK细胞表达IL-12R。
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【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】