登革Ⅱ型病毒非结构蛋白NS3的表达、鉴定及功能性初步分析

发布时间：2018-11-07 08:45

【摘要】：登革热(dengue fever, DF、登革出血热(dengue haemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合症(dengue shock syndrome, DSS)是由登革病毒(Dengue virus, DENV)引起的虫媒传染病。DENV分为4个血清型：DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ、 DENV-Ⅲ和DENV-Ⅳ.该病主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,流行于全球热带及亚热带地区。WHO估计全球每年有约发生5000万到1亿例登革热,其中超过25000人死于该疾病,特别是在亚洲、太平洋群岛及中、南美洲许多国家都已构成严重的威胁。目前,仍然没有有效的抗登革病毒药物和登革病毒疫苗用于临床。因此登革热已经成为了严重的公共卫生问题之一。登革病毒是有包膜的单股正链RNA病毒,由11000个核苷酸组成。其基因组编码成一个多肽链后,在宿主的信号肽酶及病毒编码的蛋白酶(NS3)作用下,裂解成3种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白及其前体M/prM、包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。在黄病毒属蛋白酶作用其自身编码的多聚蛋白底物的过程中,非结构蛋白3(NS3)扮演相当重要的角色。登革病毒非结构蛋白NS3是DENV的第二大非结构蛋白,基因全长1854bp,编码618个氨基酸。NS3是一种分子量为大约69KDa的亲水性的多功能蛋白,具有蛋白酶、RNA解旋酶和RNA聚合酶多重活性,在病毒的复制和成熟过程中起着重要的作用。通过生物信息学分析,NS3蛋白是亚细胞内定位在内质网上的一个膜外蛋白。NS3蛋白含两个结构域,N末端的180个氨基酸为丝氨酸蛋白酶区域,其中最少需要N端167个氨基酸才能发挥丝氨酸蛋白酶的活性；C末端的438个氨基酸含有另外三种酶结构,即RNA解旋酶和NTPase和5'RNA三磷酸酶的活性,参与病毒前体的加工和病毒RNA的复制及基因组RNA的5端加帽,即调节核酸的拓扑结构。虽然解旋酶在病毒的生命周期中尚不清楚其具体的作用,但是一般认为在病毒利用自身酶聚合时,解旋酶是暂时分离中间体dsRNA。这种分离机制将更易于病毒的几轮的复制。另外,解旋酶还可能打乱二级结构形成ssRNA模板或取代宿主其他病毒蛋白结合到dsRNA,更易于病毒RNA的复制。NS3的RNA5’三磷酸酶活性可能与病毒基因组的5’加帽反应有关,因为加帽的第一步反应是RNA5’端的磷酸集团的水解,Bartelma等人首先证实了登革病毒NS3的RNA5’三磷酸酶的活性。并有文献报道NS3蛋白具有良好的免疫原性,存在特异性的CD4+和CD8+识别表位,可诱导机体产生B、T细胞应答且可在NS2B激活蛋白酶的辅助下,促使NS3与膜的融合,诱导细胞凋亡。目前,通过设计特异性酶抑制剂作为治疗病毒疾病的药物,是一种抗病毒的新策略,在与登革病毒同属一个家族的HCV就已经取得了很大的进展,已经有HCV的NS3抑制剂类药物处于临床试验阶段。鉴于NS3同时具有病毒复制所必需的多种酶活性及其良好的免疫原性,且已有研究表明,NS3蛋白在不同血清型的登革病毒及黄病毒中相对保守,能在病人和受试者体内可诱导产生较好的免疫保护反应,故使得登革病毒NS3成为具有潜力的靶分子。为进一步研究NS3蛋白在登革病毒感染中的作用及作为检测靶抗原的可能性,本课题构建NS3蛋白的原核及真核表达载体,通过克隆,表达及纯化,探讨NS3蛋白对登革Ⅱ型病毒复制的影响,为深入阐明登革病毒的致病机理提供有意义的实验依据,为进一步设计抗病毒感染的疫苗开发提供新的思路。本研究主要结果与结论如下：一、登革病毒NS3蛋白的生物信息学分析1.利用生物信息学软件,对黄病毒属不同病毒(DENV、JEV、TBEV、WNV、YFV)的NS3蛋白及其结构域进行分析,NS3蛋白在不同的血清型及黄病毒属中存在保守序列；通过构建进化树发现,登革Ⅱ型NS3蛋白与登革Ⅳ型亲缘关系比较近,与黄病毒属中的日本脑炎病毒及西尼河病毒的亲缘关系较近。 2. Rare Codon Calcμlator分析,编码登革Ⅱ型病毒NS3蛋白的序列中存在稀有密码子；预测该蛋白质位于膜外,不存在跨膜区域；Virus-mPLoc^测此蛋白定位于病毒衣壳与宿主的内质网。二、DENV-Ⅱ-NS3蛋白的原核表达、鉴定及免疫反应性的初探 1.NS3的原核表达及重组蛋白的亲和纯化从乳鼠脑内提取登革Ⅱ型的病毒液,设计特异性引物,利用RT-PCR以DENV-Ⅱ-mRNA为模板扩增出DENV-Ⅱ-NS3编码基因NS3。将NS3全长基因连接到pMD18-T载体,通过菌落筛选,酶切及测序鉴定,挑选阳性重组质粒pMD18-T-DENV-II-NS3。以pMD18-T-DENV-II-NS3质粒为模板,通过PCR扩增出DENV-Ⅱ-NS3。将NS3全长基因插入原核表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得的pET32a-NS3/BL21(DE3)阳性菌经IPTG诱导后,超声裂解提取表达产物,融合蛋白NS3主要以包涵体的形式存在。包涵体裂解液(?)Ni-NTA亲和纯化后,获得预期大小的特异性的目标蛋白条带。用Histag单抗及登革病毒NS3多抗,经Western blo证实为所需目的蛋白,并说明DENV-Ⅱ-NS3蛋白具有一定的免疫反应性。NS3蛋白的纯化及蛋白竞争性实验的分析为抗进一步研究NS3蛋白在登革病毒感染机制中的作用奠定了良好的工作基础。 2.DENV-Ⅱ-NS3纯化蛋白的生物学功能经免疫印迹检测,DENV-Ⅱ-NS3蛋白具有一定的免疫反应性；利用BHK-21细胞繁殖登革Ⅱ型病毒,纯化病毒后并采用TCIDso方法测定收集的病毒液滴度测定滴度；纯化后的登革Ⅱ型病毒NS3纯蛋白及定量的登革Ⅱ病毒液混合后攻击BHK-21细胞,通过竞争性抑制分析,采用MTT检测宿主细胞的活力说明在一定的剂量范围内,随着纯化蛋白的量的增加,细胞的活力就越好。结果显示,原核表达的NS3重组蛋白能够在一定程度上抑制登革病毒感染宿主细胞。三、DENV-II-NS3蛋白在真核表达载体的克隆、表达及其功能性初步探索 1.真核表达质粒pcDNA-NS3P、 pcDNA-NS3H和pcDNA-NS3的构建以pMD18-T-DENV-II-NS3质粒为模板,设计两对引物,通过PCR扩增出DENVII-NS3及其结构域NS3P及NS3H编码基因。根据合适的多克隆位点分别将克隆好的三段目的基因插入真核表达载体pcDNA(+),转化大肠杆菌DH5a,获得pcDNA-NS3P/DH5α、pcDNA-NS3H/DH5aα和pcDNA-NS3/DH5a阳性菌。使用去内毒素试剂盒超纯提取质粒pcDNA-NS3P、pcDNA-NS3H、pcDNA-NS3及pcDNA (+)的DNA后,利用脂质体法瞬时转染细胞BHK-21细胞,采用半定量PCR及间接免疫荧光染色显示NS3蛋白及其结构域蛋白酶及解旋酶的表达,三种质粒分别命名为：pcDNA-NS3P、pcDNA-NS3H和pcDNA-NS3. 2.DENV-II-NS3蛋白具有抑制病毒复制的作用经大规模超纯提取质粒pcDNA-NS3P、pcDNA-NS3H、pcDNA-NS3和pcDNA(+)的DNA后,利用lip2000瞬时转染至BHK-21细胞6h后,使用MOI=1的纯化后的登革Ⅱ型病毒攻击BHK-21细胞,72h后收集细胞的总RNA,应用q-RTPCR检测各组细胞内病毒载量的变化。结果显示：转染pcNS3、pcNS3H组均与空白对照组及未转染组间的病毒载量存在着差异(p0.05),空白对照组与未转染组之间差异没有统计学意义。转染pcNS3P组虽与未转染组及空白对照组间有量的变化,但之间的差异仍无统计学意义(p0.05)。因此证实：重组质粒在真核细胞内表达的NS3蛋白及其结构域在细胞水平上能够影响登革Ⅱ型病毒进入宿主细胞。本研究分别用原核表达载体和真核表达载构建的NS3重组质粒,均从细胞水平证实登革Ⅱ型病毒非结构蛋白3(NS3)对于病毒的复制具有一定的抑制作用。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373;R3416

【参考文献】