DNA聚合酶βM162突变型碱基切除修复活性的分析

发布时间：2018-11-07 13:31

【摘要】：背景和目的 DNA聚合酶β(DNA polymeraseβ,polβ)是一种重要的DNA修复酶,它广泛存在于哺乳动物细胞内。该酶的主要功能是参与DNA的修复,在碱基切除修复(BER)过程中填补单核苷酸缺口,包括短补丁(单一核苷酸)BER途径和/或长补丁(几个核苷酸合并)BER途径,是现今已知碱基切除修复中最重要的聚合酶之一。该酶在哺乳类动物细胞的同源性和在结构进化过程中的高度保守性说明其在生命活动中起着重要作用,有人称其是生物进化过程的“看家酶”。该酶的缺陷与一些肿瘤的发生有关。目前,已在食管癌、胃癌、直肠癌、前列腺癌、鼻咽癌等多种人类肿瘤组织中发现了polβ基因的突变及表达异常。近年来,许多学者对polβ在肿瘤组织和细胞系中的突变及表达状态进行了系统的研究。然而,肿瘤组织中突变polβ的功能改变尚未见有报道。因此,本课题在课题组先前研究的基础上,构建162位Val→Ala突变型DNA聚合酶β(DNA聚合酶βM162突变型)和野生型DNA聚合酶β表达载体,诱导表达、纯化得到的重组蛋白,检测它们对单碱基缺失DNA底物的修复能力,为探讨修复基因DNA聚合酶β突变在肿瘤发生发展中的作用积累实验依据。实验方法设计一对带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位的polβcDNA引物;分别以含有野生型polβcDNA克隆pGEM-T-Wpolβ和162位Val→Ala突变型DNA聚合酶β(M162突变型)cDNA克隆pGEM-T-Mpolβ的质粒为模板进行PCR扩增;BamHⅠ和HindⅢ酶切Wpolβ和Mpolβ扩增产物,将其重组入pQE80L;利用PCR筛选和酶切鉴定得到pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolβ,进行DNA序列测定。1mmol/LIPTG分别诱导含有pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolp的大肠杆菌DH5α,37℃诱导培养5h;超声破碎细胞,并通过紫外分光光度法测定蛋白含量。然后15%SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R-250染色,甲醇-冰醋酸脱色并观察,采用凝胶分析系统扫描,分析SDS-PAGE后凝胶上的染色条带。通过Hislink~(TM)蛋白纯化试剂盒纯化蛋白,纯化的蛋白按常规法用8M尿素复性,通过紫外分光光度法测定蛋白含量,将得到的野生型和突变型DNA聚合酶β蛋白都稀释为400ng/ml。设计合成带有HindⅢ酶切位点的单碱基缺失DNA底物的三条单链P1、P2和P3,退火后合成含有一个碱基缺失的DNA底物;稀释野生型和突变型DNA聚合酶β蛋白对DNA底物进行碱基缺失的DNA底物的修复,HindⅢ酶切修复DNA底物,判定BER活性。实验结果 1.重组表达载体pQE80L-Wpolβ和pQE80L-Mpolβ经PCR和酶切鉴定,证实载体构建成功。DNA序列测定,证实表达载体的插入片段与pGEM-T-Wpolβ和pGEM-T-Mpolβ中序列完全一致。 2.通过诱导表达、纯化得到的39KD的野生型和突变型polβ蛋白,与预期的融合蛋白大小一致。 3.三条单链P1、P2、P3退火后合成含有一个碱基缺失的56bp的DNA底物,与预期大小相符。 4.在BER实验中,1:4稀释即polβ100ng/ml时,野生型polβBER活性为100%,而突变型polβBER活性仅为29%±4%;1:8稀释即polβ50ng/ml时,野生型polβBER活性为78%±9%,而突变型polβBER活性仅为5%±1.3%;1:16稀释即polβ25ng/ml时,野生型polβBER活性仍然有32%±4%,而突变型polβBER活性已经降为0%;统计学分析,在三个稀释度上,野生型polβBER活性都显著高于突变型polβ,p＜0.01,差异均有非常显著性。结论 DNA聚合酶βM162突变型,即DNA 598位T突变为C,引起polβ氨基酸162位Val突变为Ala,导致polβ蛋白活化结构域“掌部”空间结构改变,致使BER活性显著降低。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346;R73-3

【参考文献】