【摘要】： 玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)等镰刀菌产生的有毒次级代谢产物。ZEN和DON主要污染玉米、大麦、小麦等谷物及其制品,它们不仅可以导致人和动物产生生殖毒性、免疫毒性、细胞毒性,而且还与癌症有关。目前ZEN和DON等真菌毒素的检测方法主要是仪器分析方法和免疫学分析方法,而仪器分析方法存在成本高、耗时长、样品处理和净化困难等缺点,使得免疫学分析方法越来越受到分析检测部门,特别是基层检测部门的青睐。其中ELISA法以其快速、灵敏、低成本的特点被广泛应用于各种真菌毒素的检测,而制备出效价好、灵敏度高和特异性强的抗体是建立ELISA方法中的关键环节。 本研究分别采用活性酯法和Mannich法构建了ZEN的完全抗原,并采用紫外光谱法对其进行了分析和鉴定。同时采用活性酯法和N,N'-羰基二咪唑(N,N'-Carbonyldiimidazole, CDI)法分别构建了DON的免疫抗原和包被抗原,并采用2,4,6-三硝基苯磺酸(Triniro-benzene-sulfonic-acid, TNBS)法对DON完全抗原进行了分析和鉴定。以构建的完全抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,采用ELISA方法对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行了分析,具体研究内容如下。 1.ZEN完全抗原的制备 ZEN分子量为318.4,是只有反应原性而无免疫原性的半抗原,只有与载体蛋白偶联后,才能刺激机体产生抗体。本研究分别采用活性酯法和Mannich法构建了ZEN的完全抗原。采用活性酯法时,首先将ZEN衍生为ZEN肟(ZEN-oxime,ZENO),然后将ZENO与cBSA (cOVA)偶联制备了完全抗原ZENO-cBSA (cOVA);采用Mannich法时,直接利用甲醛将ZEN与BSA(OVA)偶联制备了完全抗原ZEN-BSA(OVA)。根据紫外光谱结果,可初步推测ZENO与cBSA (cOVA), ZEN与BSA(OVA)偶联成功,偶联比分别为nZENO:ncBSA=9.2:1、nZENO:ncOVA=10.3:1、nZEN:nBSA=15.9:1和nZEN:nOVA=6.8:1。 2.DON完全抗原的制备 DON分子量为296.3,根据其结构特点,本研究分别采用活性酯法和CDI法构建了DON的免疫抗原和包被抗原。采用活性酯法时,首先将DON衍生为3-半琥珀酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-HS-DON),然后将3-HS-DON与BSA偶联制备了免疫抗原3-HS-DON-BSA;采用CDI法时,直接利用CDI对DON的活化作用与OVA进行偶联制备了包被抗原DON-OVA。通过TNBS法对偶联前后载体蛋白的游离氨基数目的测定,结果表明DON与载体蛋白偶联后,载体蛋白游离氨基数目减少,初步推测完全抗原构建成功,偶联比分别为n3-HS-DON:ncBSA=9.5:1和nDON:nOVA=7.2:1。 3.抗ZEN和DON抗血清制备 将ZEN-BSA、ZENO-cBSA和3-HS-DON-cBSA(100μg/只)以多点多次的方法分别免疫BALB/c小鼠,每种抗原免疫3只并按顺序编号(1～9)。分析抗体产生进程,结果表明,从2免开始就有明显抗体产生,4免后3号小鼠效价最高可达1:12 800,而1和2号效价为1:6 400；4和5号小鼠效价最高可达1:12 800,6号小鼠效价为1:6 400；7和8号小鼠效价为1:3 200,9号小鼠效价为1:6 400。取每组中效价高的3、5和9号进行后续实验。 4.ELISA条件的优化 分别以相应的包被抗原和抗体为材料,通过方阵滴定实验获得间接竞争ELISA的最佳包被抗原和抗体工作浓度为ZEN-BSA免疫的3号小鼠抗血清以PBST稀释至1:12800, ZEN-OVA的包被浓度为1μg/mL; ZENO-cBSA免疫的5号小鼠抗血清以PBST稀释至1:12 800, ZENO-cOVA的包被浓度为1μg/mL; 3-HS-DON-cBSA免疫的9号小鼠抗血清以PBST稀释至1:12 800, DON-OVA的包被浓度为4μg/mL。 5.抗ZEN和DON抗血清的灵敏度及特异性分析 根据上述条件,采用间接竞争ELISA分别对3、5和9号小鼠的抗血清进行分析,以竞争抗原的浓度对数为横坐标,竞争抑制率为纵坐标,作竞争抑制率曲线。结果表明：3号小鼠线性方程为y=-12.92x+100.35 (R2=0.9878), ZEN的半数抑制浓度(IC50)为7.6μg/mL,检测限为0.075μg/mL,线性检测范围为0.01～10μg/mL;5号小鼠线性方程为y=-13.61x+100.95 (R2=0.9919), ZIEN的IC50为5.8μg/mL,检测限为0.093μg/mL,线性检测范围为0.01～10μg/mL;9号小鼠线性方程为y=-12.35x+101.05(R2=0.9906),DON的IC50为14.2μg/mL,检测限为0.103μg/mL,线性检测范围为0.01～100μg/mL;交叉反应结果表明,3、5和9号3只小鼠抗血清特异性良好。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392
【参考文献】
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2316574
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