人表皮细胞中侧群细胞表型的初步分析

发布时间：2018-11-09 20:08

【摘要】： 研究背景: 皮肤是人体最大的组织器官,也是始终处于不断更新状态的组织之一。皮肤组织这种不断的更新是由位于表皮基底层以及毛囊隆突部的表皮干细胞维持的。表皮干细胞的重要性不仅在于它们在创伤修复和维持内环境稳定过程中具有重要作用,而且在于它们是肿瘤发生的起始细胞和基因治疗的主要靶标。因此,表皮干细胞一直是近年来研究的热点。而如何将表皮干细胞从皮肤组织中准确的分离纯化、培养和鉴定,是研究表皮干细胞的最基本条件。但是由于表皮干细胞数量较少,且缺乏特异性分子标志,分离鉴定存在一定困难。最近研究有一种不依赖细胞表面标志物的干细胞分离方法——侧群细胞分离法,正越来越多地被广大研究者应用。侧群(side population)细胞又称SP细胞,是指一类能够将进入细胞核的亲脂性染料排出胞外的细胞。该方法最初是在对造血干细胞的研究中发现的,其基本原理就是利用了干细胞能表达ABC转运蛋白从而可以将进入胞内的DNA结合荧光染料Hoechst33342主动转运出胞外这一特异性功能。该SP细胞群在紫外光激发下,表现低荧光的特性,可以应用流式细胞仪将其分选出来。在人多种成体组织,如肝、肺、脑、神经、小肠、气管中都发现了SP细胞,该类细胞群高表达干细胞的标志物,具有干细胞的特性,富含干细胞。目的: 检测人表皮细胞中是否含有SP细胞,并研究该表型细胞是否高表达通用干细胞标志物ABCG2、表皮干细胞标志物整合素α_6和β_1,分析SP细胞是否是表皮干细胞,为进一步分离和研究表皮干细胞提供线索和基础。方法: 1、表皮单细胞悬液获取和细胞培养:收集86例16～25岁包皮环切术患者(无泌尿系感染)术后包皮组织。无菌条件下彻底清洗,去除皮下组织,经两步酶消化法分离获得表皮单细胞悬液,接种于铺有人胎盘Ⅳ型胶原的培养瓶中,用K-SFM细胞培养基培养。 2、细胞染色和SP细胞分选:取培养的第2～4代表皮细胞,消化成单细胞悬液,一组加入DNA结合荧光染料Hoechst33342,另一组同时加入维拉帕米作为对照,染色后加入碘化丙锭,用流式细胞仪分选SP细胞。 3、ABCG2、整合素α_6和β_1表达分析:收集分选的SP细胞,流式细胞仪和RT-PCR分析通用干细胞标志物ABCG2、表皮干细胞标志物整合素α_6和β_1在SP细胞中的表达情况,以同一标本总表皮细胞作为对照组。 4、统计学处理:数据以均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计软件进行配对u检验,P＜0.05为差异有统计学意义。结果: 1、表皮细胞培养24h,可见部分细胞贴壁生长。5d细胞长满单层,贴壁细胞呈多角形,胞浆透亮,胞核较大,呈现典型的铺路石状。7d细胞大部融合成片。 2、人表皮细胞中存在SP细胞,比例为0.2%～0.3%,维拉帕米阻断后SP细胞比例减少(＜0.01%)。 3、流式细胞仪和RT-PCR检测到SP细胞中有少数细胞表达干细胞标志物ABCG2以及表皮干细胞的标志物整合素α_6和β_1。 4、经统计学分析,干细胞标志物ABCG2、表皮干细胞标志物整合素α_6以及整合素β_1在SP细胞中的表达率和在总表皮细胞中的表达率差异无统计学意义(P＞0.05)。结论: 1、人表皮细胞中存在SP细胞,比例为0.2%～0.3%。 2、流式细胞仪和RT-PCR检测到SP细胞表达干细胞标志物ABCG2以及表皮干细胞的标志物整合素α_6和β_1,但与总表皮细胞比较,这些干细胞标志物在SP细胞中的表达无明显增高。 3、SP细胞分离法分选到的细胞可能不是纯化的表皮干细胞,该方法并不能分离高纯度的人表皮干细胞,尚需进一步对表皮干细胞的分离条件进行探索。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329.2

【共引文献】