丙型肝炎病毒RNA聚合酶的基因工程制备、活性测定新方法建立及初步应用

发布时间：2018-11-14 11:29

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)的感染呈世界流行趋势,是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要原因之一,近年来HCV感染率呈上升趋势,严重威胁着人类的健康。由于细胞模型与模式动物的相关研究进展缓慢,目前尚无疫苗研制成功,因此研发更有效的病毒药物迫在眉睫。HCV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRp),是HCV复制的关键酶,在正常的宿主细胞中不存在该酶的同系物,因此可以作为抗病毒研究的一个良好靶标,已用于体外筛选HCV抑制剂。体外筛选HCV RdRp抑制剂的关键是获得溶解性好、活性高的HCV RdRp蛋白,而该蛋白的C端对其酶活性及水溶性有影响。表达具有良好溶解性和酶活性的重组蛋白,对于建立RdRp活性体外测定方法具有重要意义。由于不同蛋白在不同系统中表达水平有显著差异,其对目的蛋白的生物活性也有较大影响,所以选择一种合适的表达系统对蛋白表达水平非常关键。目前可供选择的有各种不同的表达体系如细菌、昆虫细胞、酵母、哺乳动物细胞表达系统等。本研究选择了大肠杆菌、毕赤酵母及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)三种表达系统进行HCV RdRp重组蛋白的表达,成功构建了三种适用于不同表达系统的C端截短21个氨基酸的RdRp重组质粒: pet28a(+)-HCV-RdRp , pPICZα-HCV-RdRp和pcDNA3.1-HCV-RdRp,分别在大肠杆菌、毕赤酵母及哺乳动物细胞中进行表达及鉴定。对影响大肠杆菌中蛋白可溶性表达水平的多种因素进行优化,探讨了诱导时机、诱导温度及时间、诱导剂IPTG浓度等对重组蛋白可溶性表达的影响,筛选出了提高可溶表达该蛋白的最适条件。在最佳条件下,SDS-PAGE显示可以获得最多的可溶性表达蛋白,以Ni柱纯化后获得了纯化较好的HCV RdRp重组蛋白,Western blot检测蛋白具有特异性,实现了HCV RdRp蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达。通过优化pcDNA3.1载体中的序列,在5’端酶切位点之后插入转录调控序列、起始密码子、人IgG轻链可变区信号肽及8×His标签,促使蛋白分泌到细胞外,以增加细胞表达上清中HCV RdRp的获得量,瞬时转染CHO细胞后,经竞争ELISA法检测在CHO细胞上清中获得了特异性HCV-RdRp的分泌表达,表达量较低,Ni柱纯化得到重组蛋白。将克隆有HCV RdRp基因的酵母表达载体pPICZα-HCV-RdRp电转化酵母菌GS115,挑取酵母转化单菌落30℃下甲醇诱导,诱导后上清进行Western blot分析,未能检测出其在酵母中的分泌表达。将纯化的可溶性表达的HCV RdRp用于酶活性体外测定方法的建立,纳米磁分离、酶联等技术相结合,建立了一种体外检测RdRp聚合酶活性的新方法。将RNA模板修饰固定在核壳结构复合磁性纳米颗粒上并置于磁架上,再加入纯化的RdRp蛋白,rNTP,Bio-16-UTP等构成反应体系。通过掺入生物素标记单体,利用RNA依赖的RNA聚合酶的活性,使另一条RNA链得到延伸,在外磁场下分离除去非特异性吸附片段,再与酶标记的亲和素结合,洗涤后,向微孔内加入底物显色剂,通过是否显色来判定RdRp活性。初步建立体外检测HCV RdRp活性的新方法后,对参与体外复制的诸因素的反应浓度进行了优化,筛选出最佳反应条件。将建立的活性测定方法应用于对抗病毒中药库的40种中药成分进行RdRp抑制剂的筛选,暂时尚未筛选到有效的抑制剂,对中药库中其他成分的筛选等后续实验仍在进行中。本方法可直接通过显色来检测HCV RNA依赖的RNA聚合酶活性,并且可以移至96孔板内进行高通量检测,为高通量筛选HCV RdRp抑制剂奠定了基础。该研究思路国内外尚未见报道过,具有原始创新性,已申请专利。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341

【参考文献】