【摘要】： 研究背景及目的: 急性髓细胞白血病是造血干细胞恶性克隆性疾病,骨髓中白血病细胞大量增殖,抑制正常造血,导致患者中性粒细胞减少、贫血、血小板减少。如果不进行治疗,患者将在数周内死于出血和感染。目前对于急性髓细胞白血病的治疗,仍然以化疗为主,但因大多数化疗药物选择性差,毒副作用大,对正常机体免疫与造血系统有较大的损害,因此长期大剂量使用受到限制。但由于肿瘤的病因和发展机制还未充分了解,尚未能有效的防治肿瘤。要抑制肿瘤细胞的生长,一方面可以通过影响细胞周期,使其不能进行正常的有丝分裂,另一方面可以通过促进细胞凋亡,以达到治疗目的。 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)属真球目弓形虫科,是一种专性细胞内寄生原虫,可寄生于人和动物有核细胞内引起弓形虫病。研究表明弓形虫可诱发宿主细胞凋亡。本文探索弓形虫速殖子培养上清对人急性单核细胞白血病细胞THP-1的细胞增殖抑制和诱导其细胞凋亡。观察弓形虫培养上清对体外培养的THP-1细胞的形态学、细胞周期的影响,探讨弓形虫培养上清是否对THP-1细胞具有增殖抑制作用;观察弓形虫培养上清对THP-1细胞凋亡的影响;观察弓形虫培养上清作用THP-1细胞后P-p38MAPK信号转导通路和凋亡基因蛋白Fas、FasL表达的变化,探讨弓形虫培养上清诱导THP-1凋亡的相关机制。 方法: 1.采用倒置显微镜观察THP-1细胞形态变化情况;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测弓形虫培养上清对THP-1细胞增殖抑制率;采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率和细胞周期分布; 2.AO/EB染色观察细胞凋亡形态变化,观察细胞各期特征变化; Annexin V- FITC/PI双染法检测弓形虫培养上清作用后THP-1细胞早期凋亡。 3.免疫疫细胞化学法观察弓形虫培养上清处理后细胞内磷酸化P38MAPK(P-p38MAPK)、Fas和FasL蛋白表达及分布变化;采用Western blot检测弓形虫培养上清处理前后细胞内P-p38MAPK、Fas和FasL蛋白表达量的变化。 结果: 1.MTT法检测显示弓形虫培养上清能抑制THP-1细胞增殖,并呈时间 浓度依赖性。FCM检测弓形虫培养上清作用THP-1细胞72h后,G0/G1期细胞比率明显上升,而S期比率明显下降。弓形虫培养上清作用THP-1细胞72h后均出现凋亡峰,呈浓度依赖性,与对照组比较有显著差异(p0.01)。 2.弓形虫培养上清作用THP-1细胞后,经AO/EB染色,在荧光显微镜下观察,可出现明显的凋亡细胞。早期凋亡细胞,核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞,核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。随着弓形虫培养上清浓度的增加可见凋亡细胞增多,且以晚期凋亡细胞增多为主,呈浓度依赖性;Annexin V- FITC/PI双染法显示弓形虫培养上清(3.2×107/ml,6.4×107/ml)作用THP-1细胞72h后细胞凋亡率分别为(27.8267±1.1667)%和(45.283 3±1.3372)%,呈浓度依赖性,与对照组比较有显著差异(p0.01)。 3.免疫细胞化学法检测药物处理后P-p38MAPK表达增加,主要分布于细胞核与细胞浆,而阴性对照组仅弱表达。Fas、FasL蛋白上调,主要分布在细胞浆和细胞膜;Western blot法显示P-p38MAPK、Fas、FasL蛋白表达量随上清液浓度的增加而增加,呈浓度依赖性。其阴性组、72h的1/2IC50组、IC50组P-p38MAPK蛋白表达水平(相对灰度值)分别为0.2598±0.0132,0.3612±0.0083和0.5056±0.0055;Fas蛋白表达水平分别0.2874±0.0089,0.4268±0.0079和0.5971±0.0109;FasL蛋白表达水平分别为0.2124±0.0141 , 0.2988±0.0280和0.4087±0.0266;差别均有显著性意义( p 0.01)。 结论: 1.弓形虫培养上清对THP-1细胞生长具有明显的增殖抑制作用,呈时间 浓度依赖性。 2.弓形虫培养上清能影响THP-1细胞周期,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。 3.弓形虫培养上清诱导THP-1细胞凋亡机制之一可能是通过激活P-p38MAPK/Fas/FasL途径?
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R382
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