抗IgE抗体的设计与研制

发布时间：2018-11-17 10:12

【摘要】： 一般认为,IgE及其高亲和力受体FcεRI是导致过敏性疾病的关键分子。以IgE分子作为靶点获得的抗过敏药物发展较为迅速,其中,人源化抗IgE单抗Omalizumab(Xolair?)已于2003年6月获FDA批准上市,在成人中重度哮喘的临床治疗中疗效显著。目前,国内尚未开展治疗性抗IgE抗体的研制工作,因此,制备具有自主知识产权的抗IgE抗体具有重要的理论和实际意义。大量的证据显示,功能性抗IgE抗体通过拮抗IgE/FcεRI复合物的形成发挥抗过敏作用。随着核磁共振及X-射线晶体衍射技术的发展,IgE-Fc和FcεRI的晶体结构逐步得到了精确解析,从而为设计靶向药物提供了重要信息。本论文在IgE-Fc/FcεRI复合物晶体结构的基础上,利用计算机辅助分析理论确定IgE与FcεRI、IgE与功能性单抗MAE11结合的功能域,并通过实验初步证实了这一理论预测;同时,克隆、表达了IgE-Fc的缺失突变体并实现了FcεRI的膜表达,从而建立了功能性抗IgE抗体的筛选平台,制备并初步评价了几株鼠抗人IgE单克隆抗体。具体研究结果如下: (1)理论确定IgE分子的功能表位——在IgE-Fc/FcεRI复合物晶体结构的基础上搭建了IgE-Fc缺失突变体E24(IgE Cε2-Cε4)、E34(IgE Cε3-Cε4)以及FcεRI的单体模型;同时,经同源模建构建了Omalizumab鼠源母本抗体MAE11的理论模型。利用计算机图形学技术、分子模拟技术、分子对接方法以及距离几何学等理论,搭建并合理评价了E24、E34与FcεRI及MAE11的作用模式,进而从理论上确定了IgE分子的功能表位主要位于Cε3区; (2)IgE分子功能表位的实验验证——通过分子生物学技术克隆并表达了IgE-Fc分子的缺失突变体蛋白E24和E34,实验显示E24、E34均可以结合FcεRI以及奥马佐单抗,表明缺失突变体蛋白E34包含了IgE分子重要的功能表位,初步证实了计算机辅助分析的结果; (3)功能性抗IgE抗体筛选平台的建立与验证——初步分析了跨膜区序列影响蛋白细胞定位的规律,根据这一规律选择Her2的跨膜区序列,成功实现了FcεRIα胞外段的膜表达并建立了稳定株,在此基础上建立了功能抗体的筛选平台。利用奥马佐单抗能够拮抗IgE/FcεRI复合物的形成,而且不具有致过敏性的特征,对该平台进行了验证。结果显示,这一平台可以用于初步评价潜在的功能性抗IgE单抗; (4)鼠单抗的制备和初步评价——利用E34蛋白常规免疫小鼠,经细胞融合和克隆筛选,获得了六株鼠源抗IgE单抗(QME1~6),其中,只有QME5能够特异性地结合膜IgE。此外,除QME3,其余五株单抗所识别的抗原表位均与奥马佐单抗重叠;QME1~6均没有潜在的致过敏性,同时,QME5和QME6均有拮抗IgE/FcεRI复合物形成的能力。不过,由于亲和力较低(QME5和IgE结合的亲和常数为1×107 M-1),只有高摩尔比的QME5才能显示竞争能力。以上结果表明,在计算机辅助设计及理论模拟的指导下确定大分子抗原(如IgE)的功能表位、研制靶向药物的策略是可行的,这也为针对其它靶点的拮抗分子的合理设计提供了有益的理论和技术依据。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】