重组乳酸乳球菌作为黏膜输送载体的研究

发布时间：2018-11-17 11:14

【摘要】：乳酸乳球菌是一种革兰氏阳性菌，广泛应用于食品发酵工业，被认为是安全的。乳酸乳球菌作为一种理想的黏膜输送载体，具有抗原性弱、不产生胞外酶和不在胃肠道内定植的优点，尽管乳酸乳球菌在表达细菌或病毒的抗原基因方面获得了很多突破性的进展，但是乳酸乳球菌在预防高致病性禽流感H5N1病毒感染方面的研究还未开展。高致病性禽流感H5N1病毒给人类和动物的健康带来了极大的威胁。病毒基因组中的血凝素（hemagglutinin, HA）基因容易发生变异，从而导致抗原漂移或抗原转变，最终给防治禽流感病毒感染带来极大的困难与挑战。HA蛋白作为禽流感病毒的保护性抗原，已经成为禽流感疫苗开发领域的研究重点与热点。在本论文中，我们以高致病性禽流感病毒H5N1亚型的HA基因或HA1基因作为研究对象，利用非常成熟的nisin控制表达（NIsin Controlled Expression，NICE）系统，构建不同表达类型的重组乳酸乳球菌，并对联合佐剂或经肠溶胶囊包裹后的免疫效果进行评价，目的是建立以重组乳酸乳球菌为基础的疫苗输送技术平台，为防治高致病性禽流感病毒的感染提供可行的思路，进一步地，为拓宽到其它病毒抗原基因的研究提供了强有力的基础。本论文主要创新点有：（1）基于nisin诱导的表达控制系统，首次构建了三种不同表达类型的重组乳酸乳球菌。（2） HA蛋白或HA1蛋白准确定位表达在乳酸乳球菌的不同部位。（3）联合佐剂免疫后，表面展示型和分泌型重组乳酸乳球菌分别提供100％和80％的保护效率。（4）首次报道，经肠溶胶囊包裹后，表面展示型和分泌型重组乳酸乳球菌能提供100％的免疫保护。（5）成功地构建了以表面展示型和分泌型重组乳酸乳球菌为基础的禽流感疫苗黏膜输送技术平台。通过常规分子生物学方法构建了三种不同表达类型的重组乳酸乳球菌，即：非分泌型重组乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8150-HA)、分泌型重组乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8110-HA)以及表面展示展示型重组乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)。简言之，在构建pNZ8150-HA时，以质粒pGEM-HA为模板，在上、下游引物中分别设计Sca I和Hind III酶切位点，经PCR扩增得到的产物HA基因与不带分泌信号的表达质粒pNZ8150分别经过Sca I/Hind III酶切后进行连接，将连接产物命名为：pNZ8150-HA。同理，以带有分泌信号ssUSP的表达质粒pNZ8110作为骨架，以质粒pGEM-HA为模板，在上、下游引物中分别设计Nae I和Hind III位点，通过PCR反应得到的产物HA基因与带有分泌信号的表达质粒pNZ8110分别经Nae I/HindIII酶切后进行连接，连接产物命名为：pNZ8110-HA。表面展示型表达载体的构建首先以枯草芽孢杆菌基因组为模板，在上游引物中设计Spe I酶切位点，在下游引物中设计linker-1(5'tcctcctggggatcc3')，通过PCR反应得到产物pgsA基因。其次，以质粒pGEM-HA为模板，在上游引物中设计linker-2(5'ggatccccaggagga3')，在下游引物中设计Hind III酶切位点，通过PCR反应得到的产物为HA1基因。最后，由于linker-1与linker-2可以碱基互补，所以通过桥式PCR反应将pgsA基因与HA1基因融合在一起，进而获得pgsA-HA1基因。pgsA-HA1基因与表达质粒pNZ8110分别经Spe I/Hind III酶切后进行连接，连接后的产物命名为：pNZ8110-pgsA-HA1。将上述表达载体pNZ8150-HA、pNZ8110-HA和pNZ8110-pgsA-HA1分别电转至感受态细菌Lactococcus lactis NZ9000（L.lactis NZ9000），筛选到的阳性克隆分别命名为： L.lactis(pNZ8150-HA)、 L.lactis(pNZ8110-HA)和L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)。作为阴性对照，将不带外源基因的表达质粒pNZ8110也电转至感受态细菌L.lactis NZ9000中，命名为L.lactis(pNZ8110)。通过nisinA对不同表达类型的重组乳酸乳球菌进行诱导表达，其最优化的诱导表达条件是：nisinA的终浓度为1ng/ml，诱导时间为3小时。为了检测外源蛋白在乳酸乳球菌的表达定位，我们通过western blot对nisinA诱导后的L.lactis(pNZ8110)、L.lactis(pNZ8150-HA)、L.lactis(pNZ8110-HA)和L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)的上清和细菌沉淀裂解物进行了分析。Westernblot结果显示，L.lactis(pNZ8110)在上清和细菌沉淀的裂解物中没有出现特异性的HA蛋白条带，说明含空白质粒的乳酸乳球菌经nisinA诱导后并没有产生特异性的HA蛋白（约64kDa）。在L.lactis(pNZ8150-HA)的上清中没有检测到特异性条带，但在细菌沉淀裂解物中检测到了一条约64kDa的特异性条带，说明L.lactis(pNZ8150-HA)是一种非分泌型的重组乳酸乳球菌。L.lactis(pNZ8110-HA)在上清和细菌裂解物中均出现了HA特异性的条带（约64kDa），说明L.lactis(pNZ8110-HA)是分泌型的重组乳酸乳球菌。而L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)只在细菌沉淀的裂解物中发现有特异性的条带，分子量在82kDa左右（PgsA蛋白约44kDa，HA1蛋白约38kDa），在上清中并未检测到特异性条带。但是要确定L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)是表面展示型重组乳酸乳球菌还需要进一步的实验论证。通过多克隆抗-HA血清对不同表达类型的重组乳酸乳球菌的表面进行处理，经流式细胞仪与荧光显微镜分析，结果显示L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)呈阳性，说明其表面有特异性的抗原蛋白存在，而L.lactis(pNZ8110)、L.lactis(pNZ8150-HA)与L.lactis(pNZ8110-HA)均为阴性。通过western blot、流式细胞仪以及免疫荧光分析，毫无争议地证实了，三种不同表达类型的重组乳酸乳球菌获得了正确构建，并且经nisinA诱导表达后，外源蛋白准确地定位表达在乳酸乳球菌的不同部位。此外，通过Brodfford法对nisinA诱导前、后的L.lactis(pNZ8150-HA)、 L.lactis(pNZ8110-HA)以及L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)的总蛋白浓度进行了测定，表达的外源蛋白浓度分别为：1.4813mg/ml、5.7144mg/ml和5.2288mg/ml。为了摸索出最佳的免疫剂量并考察佐剂对免疫效果的影响，我们采用的免疫策略是，免疫时间：1～3天、14～16天、28～30天（共免疫9次）。考察用的免疫剂量分别为：50ul、100ul、150ul、200ul，（重组乳酸乳球菌的浓度为：1011CFU/ml）。当联合佐剂使用时，每次加入的佐剂量为1mg霍乱毒素B亚单位（CTB）。以相同剂量的PBS、 L.lactis(pNZ8110)、 PBS+CTB以及L.lactis(pNZ8110)＋CTB作为对照组。每个剂量组的小鼠数量为10只。通过ELISA检测HA特异性的血清IgG抗体和粪便IgA抗体，进而获得最优化的免疫剂量。通过比较四个不同剂量组的IgG和IgA水平，最优的免疫剂量组合是：(150ul重组乳酸乳球菌＋1mg CTB)/次，其中，L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)＋CTB组的免疫效果最好，L.lactis(pNZ8110-HA)＋CTB组其次，而L.lactis(pNZ8150-HA)＋CTB组免疫效果最差。进一步地，从ELISpot分析、血凝抑制实验和病毒攻击实验三个方面重点探讨了小鼠经这个最优剂量组合免疫后的效果，其中小鼠经L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)＋CTB或L.lactis(pNZ8110-HA)＋CTB免疫后不仅能诱导产生较高水平的体液免疫与黏膜免疫应答，而且能诱导产生细胞免疫应答。经H5N1病毒进行致死性攻击后，L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)＋CTB组的小鼠获得了完全保护，100％存活，L.lactis(pNZ8110-HA)＋CTB组的小鼠存活率为80％。这说明我们开发出来的这两种疫苗（表面展示型与分泌型重组乳酸乳球菌）在结合佐剂CTB使用后能提供有效的免疫保护。尽管黏膜免疫佐剂CTB的使用提高了重组乳酸乳球菌，尤其是表面展示型与分泌型重组乳酸乳球菌的免疫效率，但是每次较高的免疫剂量（150ul，重组乳酸乳球菌的浓度为：1011CFU/ml）、较多的免疫次数以及CTB的潜在危险促使我们找寻另外一个更安全、有效和可行的方法。我们试图希望用更少的免疫剂量和免疫次数而获得更好的免疫效果。根据重组乳酸乳球菌作为黏膜免疫输送载体的特点，大部分的重组乳酸乳球菌经口服免疫后在胃部就被强酸降解了，进入小肠部位的活菌很少，而能被小肠绒毛M细胞摄取的活菌就更少了。鉴于此，我们设计了这样一个实验，将重组乳酸乳球菌经肠溶胶囊包裹后免疫小鼠，这样既逃避了胃酸的降解，又可将重组乳酸乳球菌靶向到小肠部位，从而提高重组乳酸乳球菌的免疫效率。为了叙述的方便，我们将L.lactis(pNZ8110)、L.lactis(pNZ8150-HA)、L.lactis(pNZ8110-HA)以及L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)分别命名为L1、L2、L3和L4，它们经肠溶胶囊包裹后依次命名为：capsule-L1、capsule-L2、capsule-L3和capsule-L4。具体的免疫策略是，免疫时间为：0、2、4、6周（每隔一周免疫1次，共4次），肠溶胶囊包裹剂量为：10ul（重组乳酸乳球菌的浓度为：1011CFU/ml），免疫剂量为：1粒胶囊/次。为了更好地体现肠溶胶囊的优势，以相同剂量的PBS、L1、L2、L3和L4作为参考，其中PBS、L1与capsule-L1作为阴性对照组，每个剂量组10只小鼠。通过ELISA检测各免疫组的HA特异性的血清IgG和粪便IgA，，其中capsule-L3组与capsule-L4组的抗体水平明显高于其它免疫组，通过ELISpot检测IFN-γ的分泌水平，capsule-L3组与capsule-L4组也同样明显高于其它组。这表明，小鼠经capsule-L3或capsule-L4免疫后不仅诱导了体液免疫应答、黏膜免疫应答，而且还诱导产生了细胞免疫应答。血清的微量中和分析从另一个侧面支持了capsule-L3与capsule-L4的免疫效果。通过同型H5N1病毒的致死性攻击，capsule-L3与capsule-L4的小鼠获得了完全保护，100％存活，而其它免疫组的小鼠存活率菌低于或等于40％。因此，我们开发出的capsule-L3与capsule-L4这两种疫苗能提供很强的免疫保护功能，为防治高致病性禽流感H5N1病毒的感染提供了一个新的、可行的思路。综上所述，我们成功地构建了三种不同表达类型的重组乳酸乳球菌，经nisinA诱导表达后，HA或HA1抗原蛋白准确地定位表达在乳酸乳球菌的不同部位，分泌型重组乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8110-HA)和表面展示型重组乳酸乳球菌L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)分别联合黏膜免疫佐剂CTB使用后获得了最佳的免疫效果，说明我们开发的这两种重组乳酸乳球菌疫苗可以用于防治高致病性禽流感H5N1病毒的感染。另外， L.lactis(pNZ8110-HA)和L.lactis(pNZ8110-pgsA-HA1)分别被肠溶胶囊包裹后（即capsule-L3和capsule-L4），小鼠经capsule-L3或capsule-L4免疫后获得完全保护。这些结果显示，capsule-L3和capsule-L4这两种疫苗在预防高致病性禽流感H5N1病毒方面具有更大的潜能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【共引文献】