组织靶向肝素-SOD及季铵化壳聚糖-SOD结合物的制备及其对ROS诱导损伤的作用与机制研究

发布时间：2018-11-18 14:44

【摘要】： 活性氧族(reactive oxygen species,ROS),例如超氧阴离子自由基(O_2~-)和H_2O_2等都能造成机体氧化性应激反应,成为许多疾病比如肝损伤、肺损伤的诱导因子。超氧化物歧化酶(SOD)能够分解O_2~-,从而可防御由于氧化应激反应造成的损伤。然而体内试验却表明,SOD在抗炎、抗纤维化中发挥的作用不够理想,需要的剂量较大。造成SOD在动物实验和临床试验疗效不理想的原因是由于SOD不理想的药代动力学特点,即体内半衰期短(t_(1/2)大约6min)。为了改善SOD的药代动力学性质,提高SOD的作用效果,本文设计研究了具有长效和组织或者细胞靶向性SOD,即用阴离子多糖肝素修饰的SOD(Hep-SOD)和用阳离子多糖N,N,N-三甲基季铵化壳聚糖(TMC)修饰的SOD(TMC-SOD),及它们的理化与生物学性质和对ROS引起的损伤的作用与机制。本论文的主要研究内容与结果如下。 1 Hep-SOD与TMC-SOD的制备采用高碘酸钠氧化法活化肝素,用活化的肝素在pH9.5、0.3 mol/L碳酸盐溶液中对SOD进行化学修饰,反应产物通过电泳鉴定。对该修饰反应液进行预处理后,用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析进行修饰酶的分级分离,制备Hep-SOD结合物。 EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)缩合法制备TMC-SOD。为增加壳聚糖的水溶性和阳电荷性质,先将壳聚糖用H_2O_2法降解,再通过N-位三甲基化,得到TMC。TMC在缩合剂EDC的存在下对SOD进行修饰,得到TMC-SOD,修饰反应液进行预处理后,用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析进行修饰酶的分级分离得到TMC-SOD结合物。 SOD活性测定结果表明,天然SOD、TMC-SOD以及Hep-SOD酶活分别为3250、2830和2770U/mg。采用MTT法测定证实,SOD的两种结合物均无细胞毒性。 2 Hep-SOD、TMC-SOD的二级结构分析采用圆二色谱法(CD)对SOD及其修饰物的二级结构进行研究,并比较其差别。结果显示,在溶液状态SOD与其两种结合物的CD图谱略有差异。具体来讲,Hep-SOD比未修饰的SOD分子结构中α-helix比例增加(24.50%vs23.50%),而β-sheet的含量降低(48.3%vs49.8%),同时,Random.Coil成分比例均略有下降(30.80%vs 31.90%)。研究表明,SOD经过TCM修饰以后在二级结构上也发生了一定的变化,主要表现在α-helix降低(20.70%vs 23.50%):β-构象的含量升高(53.7%vs 49.8%),同时,Random.Coil的含量升高(37.90%vs31.90%)。但总体而言,SOD经过修饰前后对二级结构的影响都不大,这与修饰前后对SOD酶活的影响不大一致。 3 SOD结合物对巨噬细胞的靶向性研究 3.1 SOD结合物对细胞内SOD酶活、总抗氧能力(T-AOC)、超氧阴离子释放的影响本研究考察了SOD结合物对淀粉诱导的小鼠腹腔巨噬细胞内SOD酶活力和T-AOC以及对抑制o_2~-释放的影响。结果显示,正常小鼠腹腔巨噬细胞内SOD酶活性为48.344±5.39 U/mg蛋白,巨噬细胞与各用药组共同孵育以后细胞内酶活性均升高,其中SOD组细胞内酶活升高到62.92±6.00 U/mg蛋白,与正常细胞内酶活相比差异不显著(P＞0.5),而Hep-SOD组和TMC-SOD组细胞内酶活性升高均非常显著,分别达到162.2±7.20和408.04±15.91U/mg蛋白,与正常细胞内酶活相比具有显著性差异(P＜0.01)。结果还表明,正常小鼠腹腔巨噬细胞内T-AOC为9.50±1.49U/mg蛋白,巨噬细胞与各用药组共同孵育以后细胞T-AOC均升高,SOD组细胞内T-AOC升高到11.89±2.28U/mg蛋白,与正常细胞内T-AOC相比差异不显著(P＞0.5),而Hep-SOD组和TMC-SOD组细胞内T-AOC升高非常显著,分别达到32.39±2.94U/mg蛋白和71.36±5.35U/mg蛋白(P＜0.01)。研究显示,Hep-SOD和TMC-SOD均能够抑制巨噬细胞O_2~-的释放,影响趋势与各用药组对细胞内SOD酶活性的影响变化趋势基本一致,TMC-SOD用药组的抑制作用显著高于其他用药组。本研究中我们还发现,秋水仙素能够明显影响SOD两种多糖修饰物对孵育细胞内的酶活性、T-AOC以及孵育巨噬细胞抑制O_2~-的能力。尤其是TMC-SOD组,加入秋水仙素能使细胞内酶活性及T-AOC升高的趋势降低大约50%。这一发现与以前文献报导的用六亚甲基二胺作为阳离子修饰剂修饰SOD对秋水仙素不敏感不一致。有文献报导,巨噬细胞表面存在大量的甘露糖受体,该受体不仅可以与甘露糖结合,还能够与壳聚糖等结合,却不能与六亚甲基二胺结合。SOD经过TMC修饰后可以和甘露糖受体结合,而SOD经六亚甲基二胺修饰后不能与甘露糖受体结合。秋水仙素可能就是通过影响TMC-SOD与甘露糖受体的结合而影响TMC-SOD的细胞内酶活性等。 3.2流式细胞技术检测SOD结合物对巨噬细胞的结合能力本研究借助流式细胞仪检测考察SOD及其两种结合物对巨噬细胞的结合能力。FITC标记的SOD、Hep-SOD以及TMC-SOD与小鼠腹腔巨噬细胞共同孵育,结果表明,TMC-SOD对细胞的结合能力最强,其次是Hep-SOD,阳性率分别为95.36%和29.2%,而SOD孵育组阳性率只有22%;当延长孵育时间达到2h,阳性率均升高,其中SOD、Hep-SOD组分别升高到37.64%和51.81%。 3.3激光共聚焦显微镜技术研究SOD及其修饰物巨噬细胞内分布 FITC标记的SOD及SOD衍生物与巨噬细胞共孵育1h后,SOD组的荧光信号较弱,而Hep-SOD组和TMC-SOD组的荧光信号与SOD组相比有不同程度的增强,其中,Hep-SOD组荧光略强于SOD组。FITC标记的SOD及SOD衍生物与巨噬细胞共孵育2h后,荧光强度均比1h时的相同药物组有不同程度的增强,且两个修饰物组均表现出比SOD组更强的荧光强度。 4 Hep-SOD结合物对CCl_4诱导的急性肝损伤和肝纤维化的防治作用 4.1 Hep-SOD结合物对CCl_4诱导的急性肝损伤的作用本研究采用CCl_4腹腔注射诱导小鼠急性肝损伤,立即尾静脉注射给药。用药24h取血测定血清LDH、GSH和GOT/GPT活性;取肝组织测定MDA含量。结果显示,Hep-SOD以及Hep+SOD组转氨酶浓度均低于模型组,但高于正常对照组。结果还显示腹腔注射CCl_4不仅导致血液GOT/GPT、LDH以及肝组织MDA浓度升高,还同时降低GSH的浓度。研究发现,尾静脉注射Hep-SOD能够显著降低LDH,同时增高GSH的浓度。各生化指标显示,与天然SOD相比,Hep-SOD保肝作用更为显著,Hep-SOD对CCl_4诱导的急性坏死性肝损伤具有很理想的预防和保护作用。肝素用药组在本实验中没发现有明显的疗效。 4.2 Hep-SOD结合物对CCl_4诱导的肝纤维化的防治作用本研究采用CCl_4腹腔注射,每周2次,连续12周诱导小鼠肝纤维化,在CCl_4注射后立即腹腔注射给药,最后一次用药24h后眼球取血处死动物,进行以下实验。 (1)羟脯氨酸测定采用测定小鼠肝组织羟脯氨酸含量为指标考察小鼠肝脏的胶原水平。结果显示,连续12周腹腔注射CCl_4后,肝组织羟脯氨酸含量显著升高(549±39vs.1684±14μg/g湿肝重,P＜0.05);与模型组相比,各用药组羟脯氨酸含量均显著降低,SOD用药组羟脯氨酸含量为(320±57μg/g湿肝重,P＜0.5),而Hep-SOD用药组作用最明显(206±16μg/g湿肝重,P＜0.01)。 (2)肝脏病理学检测研究表明,Hep-SOD用药组和Hep+SOD用药组均能够有效降低CCl_4诱导的小鼠肝脏纤维化程度。在CCl_4连续注射12周,模型组出现纤维组织增生明显,假小叶形成,形成完整的增厚的、明显的纤维组织隔,肝细胞浊肿变性,部分呈气球样变,大量炎症细胞浸润,有片状坏死灶;部分肝细胞嗜酸性变性,细胞核缩小。Hep-SOD用药组以及肝素+SOD混合用药组能够有效降低上述病变程度,其中Hep-SOD用药组作用最明显。纤维化病例积分统计进一步说明,Hep-SOD用药组能够有效缓解CCl_4诱导的小鼠肝脏纤维化程度。 (3)Hep-SOD对小鼠肝组织相关mRNA转录水平的影响采用Real-time PCR(RT-PCR)测定Hep-SOD对小鼠肝组织TGF-β1、MMP-2、fibronectin和collage-ⅠmRNA转录影响。结果显示,连续注射CCl_4 12周能使肝组织TGF-β1 mRNA水平提高4倍,而Hep-SOD能够有效抑制这种升高趋势。研究还显示,连续注射CCl_4同样能够使MMP-2、fibronectin和collage-ⅠmRNA转录提高,但同时注射Hep-SOD能够抑制上述mRNA升高的趋势。 (4)Hep-SOD对小鼠肝组织TGF-β1蛋白表达水平的影响本研究借助Western blotting技术证明,连续CCl_4注射能够使肝组织TGF-β1表达显著提高,而这种升高趋势在Hep-SOD组、Hep+SOD混合用药组、SOD组以及肝素用药组均受到一定程度的抑制,而Hep-SOD用药组作用最为明显。 5 TMC-SOD结合物对CCl_4诱导的急性肝损伤和肝纤维化的防治作用 5.1 TMC-SOD对急性肝损伤的保护作用采用对CCl_4注射的小鼠尾静脉注射TMC-SOD。用药后24h取血处死,测定血液生化指标GOT/GPT、GSH、LDH以及肝组织中MDA含量。结果显示,CCl_4诱导急性肝损伤通过降低GSH水平、提高脂质过氧化来改变组织氧化还原状态。而上述变化在TMC-SOD用药组以及TMC+SOD用药组均得到部分抑制。各生化指标显示,与其他用药组相比,TMC-SOD组对急性肝损伤的改善作用最显著。 5.2 TMC-SOD对肝纤维化的保护作用本研究采用TMC-SOD和CCl_4同时腹腔注射小鼠,每周两次,连续12周。组织病理学以及羟脯氨酸含量测定均表明TMC-SOD能够有效防治肝纤维化。本研究还采用RT-PCR测定TGF-β1、MMP-2以及collagen-Ⅰ等的mRNA。测定结果显示,CCl_4连续注射12周能够使上述mRNA显著升高,而TMC-SOD用药组能够有效降低上述mRNA水平。此外,本研究还采用Western blotting对小鼠肝组织匀浆中TGF-β1蛋白水平进行检测,结果同样显示,TMC-SOD用药组能够有效降低TGF-β1的含量。以上结果综合表明,TMC-SOD能够有效防治急性肝损伤或肝纤维化。6采用~(125)I标记法和TCA沉淀法测定SOD及其两种多糖结合物在正常小鼠的血液半衰期和组织分布在小鼠体内对SOD的两种多糖结合物进行了药代动力学研究。首先制备~(125)I标记的SOD及其结合物——~(125)I-SOD、~(125)I-Hep-SOD和~(125)I-TMC-SOD,小鼠单次给药后,三氯醋酸(TCA)沉淀法测定血浆、组织的放射性含量,3p97软件拟合药物动力学模型,并计算相应参数。结果显示,~(125)I-Hep-SOD和~(125)I-TMC-SOD单次静脉注射后在小鼠体内的动力学过程符合两室模型。在相同剂量条件下,~(125)I-Hep-SOD和~(125)I-TMC-SOD分布相半衰期t_1/2a、消除相半衰期t_1/2β和AUC均有所增加。体内分布试验结果表明,~(125)I-Hep-SOD进入血液后首先迅速聚集到肝脏,5min和1h在肝脏组织中分别高达21.38±3.35%ID/g和14.38±2.67%ID/g;而~(125)I-TMC-SOD进入血液后则到肺脏蓄积,5min和1h在肺脏组织中分别高达24.98±1.87%ID/g和16.13±1.19%ID/g。 7本研究取得的主要结论 (1)成功制备分离得到了Hep-SOD和TMC-SOD两种多糖结合物,并借助CD技术对两种结合物二级结构进行了分析,发现该制备过程对SOD二级结构影响不大。 (2)聚阴离子黏多糖——肝素以及聚阳离子黏多糖——TMC是较理想的巨噬细胞靶向性修饰剂,其中TMC的靶向性修饰效果更好。 (3)Hep-SOD通过升高GSH的浓度和降低TGF-β1的表达,能够防治CCl_4造成的急性肝损伤和肝纤维化,该防治作用可能是结合物的抗氧化作用和抗炎作用共同作用的结果。 (4)TMC-SOD结合物防治急性肝损伤和肝纤维化作用显著。TMC-SOD将有望成为治疗由于氧化应激作用导致的肝纤维化和急性肝损伤的有效药物。 (5)与天然SOD相比,TMC-SOD以及Hep-SOD的血液半衰期显著延长;TMC-SOD和Hep-SOD均对肺脏有靶向性。 (6)SOD的肝素或者TMC化学修饰物能够有效治疗自由基介导的炎症反应;TMC-SOD以及Hep-SOD都有望成为防治ROS导致的组织损伤的理想药物。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R363

【引证文献】