小鼠基因sidt2的可变剪接研究及功能初步探讨

发布时间：2018-11-18 20:34

【摘要】： RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double strands RNA,dsRNA)引起的序列特异性转录后基因沉默过程,它具有系统性的特性,即该现象可以在细胞或组织间传递,或从亲代传递到子代。线虫sid-1基因是系统性RNAi关键基因,SID-1蛋白可能作为一种膜通道在系统性RNAi中起到转运dsRNA的作用。在大鼠、小鼠、人等多种动物中均存在sid1的同源基因,根据其序列同源性又可分为两个家族sidt1和sidt2,本论文对小鼠sidt2基因的结构和功能进行了相关的初步研究。 小鼠sidt2基因包括两条序列,即BC051101和BC023957,它们的编码区仅长度相差63个碱基,因此将其分别命名为sidt2(1)和sidt2(s)。我们通过RT-PCR检测了两条序列的组织表达谱。我们还通过基因组序列比对及PCR对二者进行了染色体定位,并构建可变剪接报告载体,观察其在细胞内的剪接行为,验证了二者为同一基因的可变剪接产物。另外,我们通过RNAi技术研究了剪接因子CLK2、SNRPB及hnRNP A1对sidt2可变剪接的影响,发现当抑制上述剪接因子表达时,内源的sidt2基因的剪接形式并未发生明显变化,推测可能与可变剪接机制复杂、参与其中的剪接因子种类复杂等有关;而hnRNPA1的抑制则会导致可变剪接报告载体载细胞内的转录受到明显抑制。 我们还对小鼠sidt2(l/s)进行了蛋白结构预测及亚细胞定位的研究,结果表明SIDT2(L/S)为多重跨膜蛋白,主要定位在细胞的膜系统。根据大鼠与小鼠sidt2(l)基因的高度同源性,我们分离培养了大鼠的原代肝细胞,并通过RT-PCR验证其中sidt2(l)占大多数。siRNA导入实验发现FAM标记的siRNA能够在不借助脂质体的条件下进入大鼠原代肝细胞,提示sidt2(l)基因可能具有协助siRNA导入细胞的作用。
[Abstract]:RNA interference (RNA interference,RNAi) is a sequence-specific post-transcriptional gene silencing process caused by double-stranded RNA (double strands RNA,dsRNA. It has a systematic characteristic, that is, the phenomenon can be transmitted between cells or tissues, or from parent to offspring. Nematode sid-1 gene is the key gene of systemic RNAi. SID-1 protein may act as a membrane channel to transport dsRNA in systemic RNAi. The homologous genes of sid1 exist in rats, mice, human and other animals. According to their homology, they can be divided into two families: sidt1 and sidt2,. In this paper, the structure and function of mouse sidt2 gene were studied. Mouse sidt2 gene consists of two sequences, BC051101 and BC023957,. Their coding region is only 63 bases different in length, so they are named sidt2 (1) and sidt2 (s). Respectively. We detected the tissue expression profiles of two sequences by RT-PCR. We also mapped the chromosomes by genomic sequence alignment and PCR, and constructed the variable splicing report vector, and observed the splicing behavior in the cells, and verified that they were the same gene variable splicing products. In addition, we studied the effect of splicing factor CLK2,SNRPB and hnRNP A1 on sidt2 variable splicing by RNAi technique. It was found that the splicing form of endogenous sidt2 gene did not change significantly when the splicing factor was inhibited. It may be related to the complexity of the variable splicing mechanism and the complexity of the splicing factors involved in it. The inhibition of hnRNPA1 resulted in significant inhibition of transcription in the cells carrying variable splicing report vector. We also studied the protein structure prediction and subcellular localization of mouse sidt2 (l / s). The results showed that SIDT2 (L / S) was a multiple transmembrane protein, mainly located in the cell membrane system. According to the high homology of sidt2 (l) gene between rats and mice, we isolated and cultured rat primary hepatocytes. The results of RT-PCR analysis showed that sidt2 (l) was the majority of them. The results of siRNA transfection showed that the siRNA labeled by FAM could enter into rat primary hepatocytes without liposome, suggesting that sidt2 (l) gene might be helpful to the introduction of siRNA into rat hepatocytes.
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346

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本文编号：2341142