5-脂氧化酶转基因小鼠模型的建立

发布时间：2018-11-19 20:10

【摘要】： 目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种严重危害人类健康的疾病,是导致心肌梗死、脑卒中等疾病的危险因素。目前国内外研究热点多集中于从基因诱导方面研究AS形成的病理机制,近年来证据表明5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LO)途径在动脉粥样硬化的形成和发展以及动脉粥样硬化斑块的不稳定性中有非常重要的作用。目前已利用5-LO敲除小鼠实验证明5-LO基因与AS发病密切相关,但5-LO缺陷小鼠并不能模拟AS病人在5-LO基因高表达状态下导致的一系列炎症反应过程,而5-LO过表达转基因小鼠模型将克服基因敲除小鼠的不足,可能成为研究AS炎症机制的理想模型。本实验利用融合表达载体pEGFP-5LO稳定转染RAW264.7细胞并初步研究其表达情况,通过显微注射法,建立5-LO过表达转基因小鼠模型,为探索5-LO基因对AS的防治作用奠定基础。方法提取人外周血总RNA作为模版,根据GenBank中5-LO基因序列设计一对引物,通过RT-PCR方法扩增出2000bp的5-LO基因全长,克隆到pUCm-T载体,通过测序证实序列的正确性。用EcoRⅠ酶切载体pEGFP-C2和pUCm-5-LO连接产物,回收、连接、转化、鉴定,从而成功构建了pEGFP-5-LO表达质粒。将pEGFP-5-LO表达质粒体外稳定转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,以转染空载体pEGFP-C2的RAW264.7细胞作对照,应用RT-PCR和Western-blot方法分析5-LO在RAW264.7细胞中的表达情况。pEGFP-5-LO质粒经StuI单酶切,QIAquick Gel extraction Kit试剂盒纯化回收约6.8kp目的片断,应用显微注射法将外源目的基因导入受精卵原核中,并将注射后的受精卵移植到同期受孕的假孕母鼠输卵管中,提取新生小鼠鼠尾基因组DNA,进行PCR和Southern blot方法鉴定,并应用RT-PCR、Western-blot、免疫组织化学等方法分析5-LO基因在转基因阳性小鼠各组织的转录特征和表达情况。结果重组质粒经酶切、测序等分析等均与预期相符,说明成功构建了pEGFP-5-LO表达质粒。通过G418筛选出稳定转染5-LO的RAW264.7细胞株,RT-PCR的方法检测到.5-LO mRNA的转录活性明显较空白对照及转染空载体pEGFP-C2的RAW264.7细胞增强(P0.05),进一步用’Western-blot方法检测到5-LO的蛋白表达水平明显较空白对照及转染空载体pEGFP-C2的RAW264.7细胞增强(P0.05),说明转染成功并且5-LO基因得到表达。显微注射166枚受精卵,并将90枚注射过的受精卵移植于3只ICR受体小鼠的输卵管中,得到25只F0代转基因小鼠。PCR、Southern杂交检测转基因阳性鼠7只,编号为1、9、13、17、20、22、24。应用RT-PCR的方法检测到转基因小鼠的骨髓细胞、腹腔细胞、肾、脾组织5-LO、FLAP、及下游相关因子的mRNA较正常鼠转录增强。Western-blot方法分析得到转基因阳性鼠骨髓细胞、腹腔细胞、肾、脾组织中5-LO、FLAP蛋白的表达明显高于正常鼠(P0.05)；免疫组织化学等方法分析得到在转基因阳性鼠肾、脾组织中5-LO、FLAP蛋白的表达明显高于正常鼠。结论 pFGFP-5-LO质粒体外稳定转染RAW264.7细胞,可以有效地使5-LO在R NA水平和蛋白质水平都具有较正常RAW264.7细胞的高表达；5-LO在小鼠基因组中得到整合并表达,5-LO途径相关因子上调,5-LO蛋白较正常鼠高表达,说明成功的建立了5-LO过表达转基因小鼠模型。
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【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R-332

【共引文献】