RpoE对伤寒沙门菌高渗应激下的基因表达调节作用

发布时间：2018-11-20 16:48

【摘要】： 目的: RpoE是肠道致病菌中重要的一个sigma因子,能启动许多基因的表达;本研究拟观察伤寒沙门菌响应环境应激时RpoE是否发挥作用以及高渗应激早期RpoE对其他基因表达调节的研究。 方法: (1)采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌rpoE缺陷变异株。根据伤寒沙门菌rpoE基因序列,设计PCR特异性引物,并在引物5′-末端加上需要的酶切位点。扩增rpoE基因上、下游片段,用BglⅡ消化后,定向连接成rpoE基因的缺损性同源性核苷酸片段。将此片段胶回收后导入自杀质粒pGMB151的BamHⅠ酶切位点,将阳性质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株(GIFU10007),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为rpoE基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。 (2)以生长时间为横坐标,OD值为纵坐标绘制生长曲线,对比rpoE基因缺陷变异株与野生株在高渗、酸、氧、胆汁应激条件下的生存情况。 (3)利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,体外模拟高渗环境应激,在低渗(50 mmol/L NaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和rpoE基因缺陷变异株4h(37℃,250r/min)至对数生长期,后转入高渗(300 mmol/L NaCl)LB培养液中在同样条件下继续培养,在高渗应激早期(30min),分别提取伤寒沙门菌野生株和rpoE基因缺陷变异株的总RNA,反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5),与基因组芯片杂交,扫描后根据荧光信号分析各基因转录表达水平,比较伤寒沙门菌野生株和rpoE基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异;选择部分差异表达基因设计并合成特异性引物,进行实时定量RT-PCR,以验证DNA芯片分析结果。 结果: (1)经PCR及序列分析证实变异株中rpoE基因缺失了288个碱基,表明成功构建伤寒沙门菌rpoE基因缺陷变异株; (2)生长曲线提示rpoE基因缺陷变异株在高渗、酸、氧应激条件下生存能力明显弱于野生株(P0.05);在胆汁应激下生存能力与野生株比较没有明显差异。 (3)基因芯片分析:高渗应激30分钟后,相比野生株,rpoE基因缺陷株有135个基因表达明显变化,其主要涉及部分热休克蛋白、鞭毛蛋白、侵袭蛋白、外膜蛋白及一些酶类、双组分调控系统phoP/phoQ和大量未知功能的推测蛋白。选取其中部份差异表达基因利用RT-PCR进行验证,结果显示所选基因与基因芯片的表达情况一致。 结论: 成功构建了伤寒沙门菌rpoE基因缺陷株,在高渗、酸、氧应激条件下rpoE基因缺陷株的生存能力明显弱于野生株(P0.05);RpoE在伤寒沙门菌高渗应激早期的基因表达调节中发挥重要作用。
[Abstract]:Objective: RpoE is an important sigma factor in intestinal pathogenic bacteria, which can activate the expression of many genes. The purpose of this study was to investigate whether RpoE plays a role in the response of Salmonella typhimurium to environmental stress and whether RpoE regulates the expression of other genes in the early stage of hyperosmotic stress. Methods: (1) rpoE deficient mutant of Salmonella typhimurium was prepared by suicide plasmid mediated homologous recombination. According to the rpoE gene sequence of Salmonella typhimurium, a specific PCR primer was designed, and the necessary endonuclease site was added to the 5- terminal of the primer. The upstream and downstream fragments of rpoE gene were amplified and digested with Bgl 鈪，

本文编号：2345441