人CD160转基因细胞株的构建及单克隆抗体的制备

发布时间：2018-11-20 17:31

【摘要】： 糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白CD160是一个27 kDa糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族,其基因定位于人染色体1q21.1。CD160最早发现于具有细胞毒活性的细胞表面,有一个IgV样结构域,由于剪接拼接的不同,CD160有四种异构体,之前的研究都是针对于传统的GPI-CD160。CD160的mRNA和蛋白在人CD56_(dim)CD16~+NK细胞,NKT细胞,肠上皮内淋巴细胞(IEL)高表达,而在B细胞和脊细胞中不表达。组织中,CD160在脾、小肠、外周血淋巴细胞中表达较高,而在脑、肝、心、胸腺等表达较低。在NK细胞上,CD160也能广泛的识别经典和非经典的MHCⅠ类分子,并在免疫应答中起到正向刺激的作用。同时,CD160跨家族结合HVEM,抑制CD4~+T细胞的增殖和细胞因子的分泌,并且降低CD3ζ链的磷酸化,产生新的共抑制信号途径,在免疫应答中起到负向抑制的作用。由于这一新的共抑制信号途径发现较晚,CD160在许多疾病中的作用尚未可知。本研究旨在克隆人CD160基因,并建立CD160的转基因细胞株,研制抗人CD160的单克隆抗体,为进一步的工作奠定物质基础。 第一部分人CD160基因的克隆、基因转染细胞株的建立及其生物学功能的初步研究 目的:克隆人CD160编码区基因,构建含有人CD160基因的重组载体,获得稳定表达基因的转基因细胞,并验证其是否具有功能性。 方法:从人外周血cDNA文库中扩增出了CD160的基因,并克隆入pMD19-T载体,另以VSIG4基因的cDNA为模板扩增跨膜区基因。将T载体和跨膜区基因双酶切后回收的两个基因片段装入pIRES2-EGFP载体,转染L929细胞。经G418筛选出稳定表达CD160分子的转基因细胞株,并命名为L929/CD160TMV。采用流式细胞仪等分析鉴定CD160分子的表达,并分析其和L929/HVEM共培养后的结合情况。 结果:成功克隆出了CD160的基因,构建了含人CD160基因的重组载体,筛选并获得稳定表达人CD160分子的转基因细胞L929/CD160TMV。初步检测该转基因细胞能结合L929/HVEM转基因细胞,证明其功能性。 结论:成功建立了可稳定表达人CD160分子的基因转染细胞,为研制抗人CD160单克隆抗体提供了有效的免疫原。 第二部分抗人CD160单克隆抗体的研制 目的:研制鼠抗人CD160单克隆抗体,为探讨CD160/HVEM相互作用对T细胞免疫应答的影响提供手段。 方法:以表达人CD160分子的基因转染细胞L929/CD160TMV为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,利用B淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏和骨髓瘤细胞株SP2/0融合,并以转基因细胞L929/CD160TMV和L929/mock分别作为阳性和阴性筛选细胞进行筛选。采用间接免疫荧光标记法流式细胞仪检测、反复筛选和多次克隆化培养,获得特异性分泌鼠抗人CD160分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法,Dot-Blot和位点竞争结合抑制等实验,对获得的杂交瘤细胞株和单克隆抗体进行鉴定。 结果:成功获得1株持续稳定分泌鼠抗CD160单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2,经Ig亚型快速定性试纸分析显示,其重链为IgG1亚类,轻链则为κ链。Dot-Blot鉴定分析,3E2能与L929/CD160TMV细胞裂解液反应,而不与L929,L929/mock细胞裂解液反应。竞争结合抑制实验显示,3E2和商品化抗体识别不同抗原表位,不产生竞争作用。 结论:成功获得1株稳定分泌特异性鼠抗人CD160单抗的杂交瘤细胞株,且与商品化抗体识别不同抗原表位,从而为研究CD160/HVEM共抑制信号对T细胞的抑制性调节提供手段。 综上所述,本课题成功建立了可稳定表达人CD160分子的基因转染细胞,为研制抗人CD160单克隆抗体提供了有效地免疫原并成功获得1株稳定分泌特异性鼠抗人CD160单抗的杂交瘤细胞株,与商品化抗体识别不同抗原表位,为研究CD160/HVEM共抑制信号对T细胞免疫应答的影响提供手段。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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本文编号：2345533