HCV核心蛋白长期稳定表达小鼠模型的建立

发布时间：2018-11-21 20:36

【摘要】： 丙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的疾病。丙型肝炎病毒感染是造成慢性肝炎,肝硬化及肝癌的主要原因之一,全球大约有1.7亿人感染HCV。目前尚无有效的防治方法,IFN-α和利巴韦林联合治疗是临床上标准的治疗方法,但只对不到50%的患者有效。 HCV是一单股正链RNA病毒,病毒基因组全长9600bp,含有一个大的开放读码框(open reading region,ORF)。它编码一个多聚蛋白前体,经宿主信号肽酶和病毒基因编码的蛋白酶切割产生4个结构蛋白(核心蛋白、包膜蛋白E1、E2和P7)和6个非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。核心蛋白是HCV编码的一个重要结构蛋白,位于整个多聚蛋白的N-末端,是病毒核衣壳的组成部分,在不同型的HCV中具有高度的保守性。越来越多的研究结果表明核心蛋白与HCV感染所致肝细胞癌的发生有密切关系。但由于HCV具有极强的宿主特异性,目前对HCV及核心蛋白的机制和功能的研究多在细胞模型,缺乏合适的小动物模型阻碍了在动物整体水平上的研究。我国HCV流行株主要为基因1b型,且感染1b型HCV患者运用IFN治疗效果较差,与肝硬化及肝癌的关系较为密切。因此研究1b型HCV核心蛋白在HCV持续感染及肝癌发病机制中的作用,对防治我国丙型肝炎具有重要的实际意义。因此本课题基于成年小鼠,联合水动力转染技术与噬菌体整合酶系统,建立1b型HCV核心蛋白长期稳定表达小鼠模型,作为经典转基因技术的补充,并初步将其用于HCV核心蛋白抑制剂-shRNAs在体内抗HCV的作用效果的评价。具体研究内容及结果如下: 1.构建HCV核心蛋白表达载体pGL3-attB-Core-Fluc。该载体含有核心蛋白基因、报告基因Fluc和?C31整合酶识别位点attB。将pGL3-attB-Core-Fluc与对照载体pGL3-attB-Core、pGL3-attB-Fluc转染Huh7细胞,pGL3-attB-Core-Fluc核心蛋白表达量与pGL3-attB-Core核心蛋白表达量是一致的,而pGL3-attB-Core-Fluc的Fluc活性却低于pGL3-attB-Fluc。在C57BL/6小鼠体内也证实了上述结果。 2.利用?C31整合酶介导位点特异性整合的特点,建立HCV核心蛋白稳定表达小鼠模型。通过水动力转染技术将核心蛋白表达载体pGL3-attB-Core-Fluc与编码?C31整合酶的表达载体pCMV-int共转染至小鼠体内。实验证实,在?C31整合酶作用下,HCV核心蛋白及报告基因Fluc整合到小鼠肝脏第2号染色体的mpsL1位点,在小鼠肝脏获得稳定表达,长达420d。 3.在上述动物模型基础上,对靶向HCV核心蛋白不同位点的shRNAs进行了体内作用效果的评价。本实验在pSilencerTM2.1-U6 neo载体基础上,构建发夹型siRNA-shRNA452、shRNA479、shRNA523表达质粒。结果显示:在细胞水平, shRNA-452、shRNA-479和shRNA-523对核心蛋白和报告基因Fluc均有抑制作用,抑制率可达到40-55%;在核心蛋白瞬时表达小鼠模型中, shRNA-Fluc和shRNA-523的抑制作用在转染后24 hr已被检测到,并且随时间的延长抑制作用更加明显。而shRNA-452在转染后48 hr还未出现抑制作用;在核心蛋白稳定表达小鼠模型中,在第6hr、12hr,shRNA523抑制Fluc的活性分别达到了76.4±26.0%和91.8±8.0%,一次注射该抑制作用持续24hr。总之,本研究将水动力转染技术及噬菌体整合酶系统联合应用,建立了HCV核心蛋白长期稳定表达小鼠模型。利用该模型可以在小鼠体内实时监测靶向HCV核心蛋白shRNA的作用。这种新颖而简单的方法可用于评价抗HCV核酸药物。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R-332

【参考文献】