干扰素-γ与骨髓间充质干细胞免疫调节协同作用机制研究

发布时间：2018-11-23 19:03

【摘要】： 第一部分：干扰素-γ与骨髓间充质干细胞免疫调节协同作用机制研究 [目的] 1探讨骨髓间充质干细胞(MSC)在体外对T淋巴细胞增殖的抑制作用,研究其主要作用机制。 2探讨干扰素—γ(IFN—γ)作用下MSC免疫活性变化情况,阐明IFN—γ与MSC在免疫调节中的协同作用。 [方法] 1采用密度梯度离心法或直接贴壁法从正常成人骨髓中分离扩增MSC,取培养后3-5代细胞用于实验研究。 2酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测MSC单独培养、MSC与IFN-γ共培养后培养上清液中前列腺素E2(PGE2)、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子—β1(TGF-β1)表达水平,比较IFN-γ作用下MSC分泌可溶性因子水平变化情况；采用抗CD3单克隆抗体(mAb)和抗CD28mAb刺激T淋巴细胞增殖,在培养体系中加入HGF或TGF-β1等细胞因子,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)ELISA试剂盒检测上述细胞因子对T细胞增殖的影响。 3提取MSC细胞RNA,采用逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测MSC细胞内吲哚胺2,3—双加氧酶(IDO)表达水平；将MSC与IFN-γ共培养48h后,RT—PCR方法再次检测IDO表达水平,与MSC单独培养时进行比较；采用不同浓度IFN-γ与MSC共培养,检测MSC细胞内IDO表达水平变化情况；在T细胞培养体系中加入犬尿酸(100μM),BrdU试剂盒检测T细胞增殖变化,探讨IDO的免疫抑制作用。 4将MSC加入T细胞培养体系中,BrdU试剂盒检测T细胞增殖水平,验证MSC在体外对T淋巴细胞增殖的抑制作用；在反应体系中分别加入IFN—γ及鼠抗人IFN—γmAb,检测T细胞增殖水平变化情况。 [结果] 1采用密度梯度离心法和直接贴壁法培养获得的MSC在形态和增殖速度方面没有明显差异。原代细胞接种于塑料培养瓶后呈集落样生长,经过2-3周左右细胞贴壁生长融合达80～90%,消化后平均每个底面积25 cm2的培养瓶可获得3～4×105细胞,之后按照1：2或1：3比例进行传代。传至第3-4代时,可获得约3～5×106细胞,供实验使用或液氮冻存。 2将3份MSC标本按1×105细胞／孔接种于24孔板,每24h留取细胞培养上清液。在培养24-48h内即可检测到PGE2、HGF和TGF—β1三种细胞因子表达。并且随着培养时间延长,上清液中上述细胞因子浓度逐渐升高,至培养后144h(6d),三种细胞因子表达水平均趋于稳定。设置实验组与对照组,实验组中MSC与IFN—γ(100ng／m1)共培养,对照组中MSC单独培养。144h后留取两组细胞培养上清液,实验组上清液中PGE2浓度为1715.5167±628.5726pg／ml,而对照组PGE2浓度为1344.5163±709.3583pg／ml,较实验组明显降低,差异具有显著统计学意义(P=0.001)。实验组上清液中HGF浓度为4031.7733±1496.8027pg／ml,对照组HGF浓度为2452.4267±1375.3291 pg／ml,较实验组明显降低(P=0.011)。实验组上清液中TGF—β1浓度为1753.5363±413.8059 pg／ml,对照组TGF—β1浓度为1026.6080±450.5418pg／ml,亦较实验组明显降低(P0.001)。外周血T细胞在抗CD3mAb和抗CD28mAb的刺激下显著增殖,加入HGF浓度分别为10ng／ml、20ng／ml和40ng／ml时,T细胞增殖的抑制率分别为(17.4750±9.8577)%、(27.7183±8.6342)%和(36.6233±11.8959)%,随着HGF浓度升高,对T细胞增殖的抑制作用也越强。HGF浓度为40ng／ml时,T细胞增殖抑制率明显高于HGF浓度10ng／ml组(P=0.005)。加入TGF—β1浓度分别为500pg／ml、1000pg／ml和2000pg／ml时,T细胞增殖的抑制率分别为(13.2163±6.0858)%、(20.6529±7.3306)%和(32.5013±11.2595)%。TGF—β1浓度为2000pg／ml时,T细胞增殖抑制率明显高于TGF—β1浓度500pg／ml组(P0.001)和1000pg／ml组(P=0.015)。 3在T淋巴细胞培养体系中加入外源性犬尿酸(100μM)后,T细胞增殖明显受抑,较阳性对照组明显减低(P=0.004)。 MSC单独培养后提取细胞总RNA,半定量RT—PCR方法未检测到明显IDOmRNA表达。将MSC与IFN—γ(100ng／ml)共培养后,IDOmRNA明显高表达。此外,在极低浓度IFN—γ(1ng/ml)作用下,即可检测到IDOmRNA表达。 4 MSC显著抑制抗CD3mAb和抗CD28mAb刺激下的T细胞增殖,并且随着MSC细胞密度增高,对T细胞增殖的抑制作用也越强。将MSC(2×104细胞／孔)与不同供者来源T细胞(1×105细胞／孔)共培养,T细胞增殖均显著受抑(P0.001)。在上述MSC与T细胞混合培养体系中加入IFN—γ(100ng/ml),不会影响MSC对T细胞增殖的抑制作用(P=0.272)；相反,在反应体系中加入鼠抗人IFN—γmAb(5μg/ml)以拮抗IFN—γ的作用,MSC的免疫抑制作用即显著减弱(P=0.002),T细胞增殖部分恢复。 [结论] 1 MSC组成性表达PGE2、HGF及TGF-β1等可溶性因子,其表达水平在体外实验中均可抑制T淋巴细胞增殖,此为MSC免疫抑制作用的主要机制之一。在一定水平IFN-γ作用下,MSC分泌上述三种免疫抑制性细胞因子水平上调,证实IFN-γ与MSC在免疫抑制中的协同作用。 2 IDO通过降解色氨酸为犬尿酸抑制T淋巴细胞增殖。MSC单独培养时不表达IDO活性,但是在IFN-γ诱导作用下,IDO表达水平显著增高,此亦为MSC发挥免疫抑制作用的主要机制之一 3骨髓MSC在体外显著抑制异基因T淋巴细胞增殖,并且此抑制作用没有MHC限制性。外源性IFN-γ不仅不会削弱MSC的免疫抑制活性,而且同样具有抑制T细胞增殖的作用,加入IFN-γmAb后可以逆转MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用。第二部分：造血干细胞移植供受者乙型肝炎病毒感染的临床随访研究 [目的] 分析移植前乙型肝炎病毒(HBV)感染的供、受者在异基因造血干细胞移植(allo—HSCT)后,受者HBV血清学标记变化及对临床结果的影响。 [方法] 对我院2002年9月至2008年11月间allo—HSCT治疗前供、受者合并HBV感染的79例患者进行随访研究,对其疾病预后与转归、移植后肝功能及HBV血清学标记变化等临床资料进行回顾性分析。 [结果] 1移植前供、受者HBV感染对受者预后无明显影响。 2 HBsAgI阳性组患者20例,13例(65.0%)出现HBV激活,时间为移植后1(0.5-10)月,9例(45.0%)并发乙肝相关肝炎。 3 HBsAg阴性组患者35例,4例(11.4%)移植后HBsAg转为阳性,即出现乙肝血清学转换,其中1例伴随严重慢性移植物抗宿主病(cGVHD). 4 HBsAg阳性组患者移植后出现HBV激活及+100d内肝功能损害的比例均明显高于HBsAg阴性组患者(P0.05)。 52例(10.0%)HBsAg阳性患者在移植后清除体内HBV,其供者乙肝血清学标志均为HBsAb阳性。 [结论] 1供、受者HBV感染不是allo—HSCT禁忌证。 2 HBsAg阳性是移植后发生HBV激活的高危因素,对于这类患者应进行规范性拉米夫定预防性治疗。 3 HBcAb／HBeAb阳性患者移植后可能出现乙肝血清学转换,在免疫抑制剂减量过程中应密切监测其乙肝血清学标记变化情况。 4 allo—HSCT可以通过过继免疫治疗清除患者体内HBV。
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【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】